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四川大学蔡潇潇教授课题组《Adv. Mater.》：动态DNA纳米盒实现可控性包裹和释放siRNA

时间：2022-05-10 来源： 浏览：

四川大学蔡潇潇教授课题组《Adv. Mater.》：动态DNA纳米盒实现可控性包裹和释放siRNA

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#DNA纳米技术 1 个
#siRNA递送与控释 1 个
#pH响应性开关 1 个
#动态框架核酸 1 个
#溶酶体靶向 1 个

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通过siRNA精准调控靶基因的表达是近年来疾病治疗相关研究的热点方向。已表现出的显著治疗效果和仍存在的改进空间激励着大量研究团队的不断探索。siRNA应用的难点仍然是其递送效率的不足，包括难入胞性、酶降解、溶酶体逃逸等挑战。四面体框架核酸 (tFNA) 作为一种3 D 的 DNA纳米结构 ，基于其高效的自组装合成方式、尺寸的可控性和可定制式优化的多功能修饰等优势，在寡核苷酸递送中获得了广泛的关注，具有极高的研究和应用前景。
近日，四川大学华西口腔医学院蔡潇潇教授课题组在《 Advanced Materials 》 期刊上发表了题为“ A Lysosome-activated Tetrahedral Nanobox for Encapsulated siRNA Delivery ”的研究型文章（ DOI:10.1002/adma.202201731） 。该研究未采用常规粘性末端搭载目标siRNA，而是通过两端互补配对的方式将靶siRNA嵌入到载体内部，利用了 tFNA 固有的稳定空间提供保护作用。在保护性递送的基础上，进一步通过加入富C（ Cytosine -rich）序列来增加pH响应性开关，使得该载体在进入细胞后可通过溶酶体的富氢离子特性将结构打开，从而获得目的siRNA的可控性释放。该动态D NA 纳米盒独特的搭载方式能够显著提高被递送siRNA的抗酶降解和抗血清降解能力，并提供足够的“锁定”能力避免在递送过程中出现货物-载体意外分离。此外，该富C序列可以在溶酶体生理pH（约4.5-5.5）下，形成i-motif四链结构，使纳米盒从关闭状态转变为开放状态，配合37℃的生理温度驱动，最终实现siRNA主动释放。该研究对所设计的动态D NA 纳米盒进行了细胞内追踪，从入胞、主动释放到溶酶体逃逸、细胞内siRNA的成熟前剪切，证实了所包裹搭载的siRNA能够突破从胞外到胞质内的多层屏障，最终实现靶mRNA的有效沉默。研究设计的 tFNA 边长为 30 bp ，可以容纳绝大多数siRNA的尺寸，能够为其他常规长度 siRNA 的沉默递送提供新思路，在小 RNA 递送系统领域具有广阔的前景。
 

图1动态D NA 纳米盒的设计与表征 (a) 动态D NA 纳米盒合成示意图 (b) 2% 琼脂糖电泳凝胶图 (c) 5% PAGE 结果通过荧光淬灭反应证实所搭载siRNA成功嵌入纳米盒的内部空间  (d) 动态D NA 纳米盒的溶酶体响应性开关示意图 (e) 通过荧光淬灭反应证实开关在不同pH下的打开程度（ pH = 8.0、7.0、6.0、5.5、5.0、4.5 和  4.0） (f) 对比动态 DNA 纳米盒  ( 含有富C序列 ) 和 静态 DNA 纳米盒  ( 对应随机序列，无pH响应性 ) 在 pH 8 和 pH 5 条件下的结构变化。
 

图2动态D NA 纳米盒所包裹的siRNA的稳定性与释放能力评估  (a -f ) 评估了游离siRNA和动态D NA 纳米盒搭载的siRN A 对R NA 酶A降解和血清降解的抵抗性。证实了嵌入性包裹的方式能够为siRNA提供明显的保护作用  ( g-j ) 对比动态 DNA 纳米盒  ( 嵌入式搭载目的siRNA ) 和 常规tFN A ( 黏性末端式搭载目的siRNA ) 在 不同 pH 和不同温度下递送和控释能力。
 

 

图 3 动态D NA 纳米盒-siRNA在巨噬细胞内的轨迹追踪  (a -c ) 流式细胞术 检测和分析游离 siRNA 以及常规 tFNA、 动态D NA 纳米盒、 Lipo fectamine  3000 搭载siRNA的入胞情况  (d -e ) 共聚焦 显微镜下观察pH响应性开关在入胞后溶酶体内的打开情况（红色箭头指示没有 Cy3信号重叠的 单独 Cy5信号。白色箭头 指示伴随 Cy3信号 重叠的 Cy5信号 ）  (f) 共聚焦 显微镜下观察孵育动态D NA 纳米盒-siRNA  3小时、6小时、12小时和24小时后，巨噬细胞中 siRNA的溶酶体逃逸情况（红色箭头指示尚未从溶酶体内逃逸的siRNA与溶酶体发生荧光信号的重叠，白色箭头指示已从溶酶体内逃逸的siRNA的 Cy5信号 ） (g) 通过小RNA qPCR 分析的游离 siRNA 以及常规 tFNA、 动态D NA 纳米盒、 Lipo fectamine  3000 搭载的siRNA在细胞内被剪切成为成熟siRNA后，siRNA正义链的相对水平。
 

图 4 动态D NA 纳米盒搭载抗T NF α-mRNA的siRNA在巨噬细胞中的基因沉默效果  (a) 示意图显示了 巨噬细胞内动态D NA 纳米盒-siRNA发挥基因沉默作用的过程。 (b -c ) qPCR和E LISA 分别从基因水平和蛋白水平分析了游离 siRNA 以及常规 tFNA、 动态D NA 纳米盒、 Lipo fectamine  3000 搭载的siRNA转染后，炎症状态下细胞内 TNFα mRNA 表达水平 以及 TNFα 的分泌水平  (d -e ) 荧光显微镜下观察巨噬细胞中活性氧的表达水平。
 

 
图 5. 动态D NA 纳米盒搭载抗T NF α-mRNA的siRNA在小鼠体内的基因沉默效果  (a) 小鼠腹腔注射动态D NA 纳米盒-siRNA后，在不同时间（ 30分钟、1小时、2小时、3小时、6小时、12小时和24小时） 进行体内荧光分布和离体器官的荧光图像拍摄  (b) C57BL/6 小鼠的血清、腹膜液和 气管灌洗液内的 TNFα 蛋白水平  (c) 组织器官（肝脏、脾脏和肺部）中 TNFα 的mRNA水平 (d) 肝脏 内 TNFα 阳性细胞分布情况  (e) 肝 脏和血清中的 ALT活性 分析。
 
这些结果证实纳米盒的四面体结构为目的 siRNA 提供了显著的保护作用以及运输过程中的递送稳定性。此外，溶酶体响应的动态开关允许目的 siRNA在 生理温度下主动地可控地释放。体外实验和体内实验均实现了对靶标 TNFα mRNA的优异的基因沉默效果。动态D NA 纳米盒被认为可为 siRNA 用于疾病治疗提供一个动态的 pH 限制的递送系统，并且可以成为其他小 RNA 载体设计的可扩展思路。
 
原文链接
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.202201731

作者简介

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四川大学华西口腔医学院在读博士生 高阳 为该文章的第一作者，通讯作者为四川大学华西口腔医学院 蔡潇潇 教授
 
蔡潇潇 ，女，教授，主任医师，博士生导师，科研工作主要从事口腔组织工程与核酸纳米材料研究；临床工作主要从事口腔种植学工作。发表第一/通讯作者SCI论著90篇（累积影响因子578），包括Advanced Materials、Small、Bioactive Materials、Bone Research等，封面论文11篇，ESI高被引论文3篇，最高影响因子30，影响因子＞10的7篇，影响因子＞6的57篇，主编英文专著2部，累计SCI他引2900余次，H-Index=31，担任Journal of Biomedical Nanotechnology（SCI）副主编，6本SCI期刊编委，担任International College of Dentistry Fellow。主编英文专著2部。主持国家自然科学基金5项。获得全国百篇优秀博士论文提名奖、四川省优秀博士论文、7次全国BITC种植病例大赛金奖等。

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