片段法合成多肽的研究

-2005.No.6化学与生物工程Chemistry & Bioengineering片段法合成多肽的研究南亚萍(西安建筑科技大学环境与市政工程学院，陕西西安710055)摘要:以片段合成法和直接合成法分别合成一个比较长的多肽，并用质谱和HPLC进行检测，结果显示用片段合成法合成的多肽,其合成效率、合成纯度均明显高于直接法。关键词:多肽;片段合成;直接合成中图分类号:Q 593.1 Q 516.文献标识码:A文章编号:1672- 5425(2005)06一0034 - 03随着人类基因组计划的阶段性完成,研究重点已基甲酰胺洗涤3遍。经越来越多地转向了蛋白质组计划。从20世纪60年1.2.2 肽键的形成代以后开始的固相化学合成多肽的方法,为合成较短将上述树脂与3.5倍Fmoc保护的氨基酸、3.5氨基酸多肽提供了很好的途径1.2],而在实际操作中倍的HBTU和HOBT、7倍的DIPEA混合反应。1 h合成含30个以上氨基酸的多肽相当困难[3],现在有研后选取少量树脂进行茚三酮检测,阴性结果的进行下究用片段合成法合成更长的多肽片段或蛋白质,将较一步反应，阳性结果的继续本步反应。长片段的多肽分成几个部分分别合成,然后再通过一按照多肽的序列顺序,依次经过1.2.1和1.2.2定的方法把合成好的较短的多肽段连接起来,最后形反应，直至连接完毕所有的氨基酸。成一个长的完整的多肽片段。1.2.3最后的Fmoc保护基团的脱除作者采用片段合成法合成含27个氨基酸的多肽，将反应完毕的氨基酸树脂用5 mL二甲基甲酰胺其序列为GIGRKFLGCVKTTFRGGVKFGDYKT-洗涤3遍后,用15 mL 30%的Piperidine 二甲基甲酰TI,分子量2950. 4,并与直接合成法进行比较。胺溶液浸泡10 min,滤干,再加入15 mL 30%的Piper-idine二甲基甲酰胺溶液浸泡10 min,做最后的Fmoc1实验保护基团的脱除。l.1试剂和材料1.2.4把多肽从树脂.上切除并同时脱去侧链保护基团选用FmocAA-wangresin,AM-Resin树脂，交联把上述脱去最后的Fmoc的氨基酸树脂1 g置入度为1%,HMPBLinker,Fmoc保护的氨基酸由默克玻璃反应瓶中,加入15 mL裂解液(TFA : Thioanisole公司提供;HATU、HBTU.HOBT由ABI公司提供;:EDT:Anisole=90:5:3:2)反应3h。把合成好TFA .DCM .DMF、Piperidine由SIGMA公司提供;其的多肽从树脂上切除下来，同时把多肽侧链的保护基它试剂均为国产分析纯。团切除,得到需要的多肽。Fmoc脱保护试剂为30%的Piperidine二甲基甲1.3片段缩合法[6]酰胺溶液。把多肽分成两部分,第一-部分GVKFGDYKTTI,1.2直接合成法[.5]第二部分GIGRKFLGCVKTTFRG。1.2.1 在树脂上脱除Fmoc基团第一部分的合成同1.2。第二部分按照下面方法起始的Fmoc-氨基酸树脂(Fmoc-AA- wang res-连接在树脂上并合成,然后把第二部分得到的片段同in,替代度0.3 mmol. g')0.5 g用10 mL DCM浸泡第一部分相连接。20min,滤去DCM,继续用5mLDCM洗涤2遍,然后1.3.1，Free但护的每其酸和HMPBLinker反应中国煤化工用5mLDMF洗涤2遍后,加入30%的Piperidine二ut度0.5 mmol.g")甲基甲酰胺反应5 min,抽干,再加人30%的Piperi-1.5 g置八仪w心1。用1 DCM浸泡20 min，抽THCNMHGdine二甲基甲酰胺反应10 min,最后加人10 mL二甲干后,用15 mL DCM洗涤2遍,然后用20 mL DMF收稿日期:2005-04- 08作者简介:南亚萍(1976- ).女,陕西户县人,助教,硕士,主要从事生物化学方面的研究。南亚萍:片段法合成多肽的研究/2005年第6期35洗涤3遍,最后加入Fmoc保护的氨基酸和HATU反应过程,直至第二部分和第一部分反应完全停止。应1.5 h。1.3.5最后Fmoc保护基团的脱除和从树脂上切除1.3.2 肽键的形成同1.2.2.多肽.1.3.3侧链全保护的肽链的切割.1.3.4反应得到的氨基酸树脂同1.2 中得到的连接好氨基酸的树脂不用脱去最后一个Fmoc基样,可以采用1.2.3 和1.2.4的办法脱除最后一个团，就可以直接从树脂上切割得到全保护的多肽片段。Fmoc保护基团并从树脂上切除,同时可以把多肽侧采用含1%TFA的DCM溶液洗涤树脂20min后就可以链的保护基团从多肽上切除掉。把侧链带保护的多肽片段从树脂上切割下来。然后把切2合成多肽的质谱鉴定和HPLC鉴定割液在旋转蒸发仪上旋干,就得到固体的保护片段。1.3.4 片段缩合2.1 质谱鉴定把1.3.3中得到的片段经纯化后同第--部分的多把反应得到的多肽采用MALDI-TOF质谱进行肽树脂反应,反应时间为24 h。其间用茚三酮监测反分子量鉴定,质谱图见图1(a)、(b)、(c)。180016041[69200p1400(a)20}an)120070复100800F600f4003020020n0112403460 420026-- 4-82620242832”Mass(m/z)/minVtyoger SpA->=A+C20.50.1)-RSM00000→>IR≈TR >Y[BP 3026.815140)01600500(b,(b)10000800600ofIMl1200 196027203480424050200-一412Mas(m/2)mun1800[00N200)->0C->TR->7RB-951583.1546710090有80-(c,)(e)昌800400sL__2000260032003800Mas (m公)tin图1质谱图和 HPLC谱图Fig. 1 Mass spectra and HPL中国煤化工al ,a2 :direct synthesis b ,b2 :segment 2:YHCNMHG2.2 HPLC 鉴定及纯化A含0.1% TFA的水,B含0.08% TFA的乙腈。条1.2.4和1.3.5得到的多肽采用C18反相柱，件一:在40 min内流动相B从10%.上升到50%;条件1.3.3得到的保护片段采用C.反相柱。流动相条件:.二:在25 min内流动相B从30%.上升到65%。 HPLC36南亚萍:片段法合成多肽的研究/2005年第6期谱图见图1(a2)、(b2)、(c2)。到保护片段时,TFA的浓度对于切割结果有很大的影响”。尤其在分离切割液和保护片段过程中(2),经常3结果与讨论.会由于TFA的浓度增加导致保护基团的脱除,如何3.1 片段合成法与直接合成法的比较选用合适的连接剂还有待更深人的研究。本实验合成的多肽片段理论分子量为2950. 4,通在片段合成过程中,如何选取片段[8]也是合成的过MALDI-TOF质谱可以很直观地测量出样品的分关键。在选取片段时,要注意的是选取的片段要容易子量。从图1(a)可以看出2951.6的分子量,并在以.合成,得到比较纯的产物,这样才能得到更多的目的片后的HPLC分离得到该分子量的物质,证明通过直接段产物,同时纯化过程也较容易进行。此外，还要注法可以合成得到该多肽。一般认为,质谱得到的数据意,选取的几个片段还要很好连接,否则,会导致最后高低与样品实际各物质的含量并不完全成比例关系，产物产率很低或者目的产物分离困难。如何在一个特但如果某种物质含量比较多,在质谱中的数据也显示定序列中选取保护片段，也需要进一步做更深人的得比较多。从图1(a1)可以看到2951.6的数据峰值相研究。对较低,证明直接合成法对于这样一-个比较长的多肽4结论来说,效率是很低的。同样的结果在HPLC中也可以看到。在图1(a2)用片段合成法合成长的多肽,其合成效率、合成纯中保留时间为25.324的峰是目的肽，该峰与整个峰面度均明显高于直接法,具有良好的研究前景。积相比表明目的产物和其它杂质的相对含量。同时，参考文献:由于长肽的合成过程中会产生大量的残缺肽，HPLC[1] Atherton E.Sheppard R C. Solid Phase Peptide Synthesis a Prac-tical Approach[ M]. New York: Oxford University Press, 1989:的峰中,选择目的峰也是非常困难的- - 件事。15-16.图1(b1 )是保护片段的质谱结果,可以看到，测量2] Chan W C,White P D. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A的结果3026. 58和理论计算值3025. 7相吻合,而且由Practical Approach[M]. New York: Oxford University Press,于所选的片段的氨基酸数目比较少,合成得到的产物200011-15.也比较纯。图1(b2)(保 留时间为11. 596的峰是目的3] 麻远.赵玉芬.多肽片段连接:合成蛋白质的一一种新方法[J].科学通报.2002.47(16) :393-400.部分)也表明了所合成得到的片段的纯度比较高,很容.4] 刘杰,高晨吴,甘一如，等. Fmoc新型固相法合成胸腺素a1及其易从粗品中纯化出来。反应途径[J].天津药学,2001, 13 (3):39-41.图1(c)显示了采用片段缩合法得到的完整肽的5] 王贤纯,梁宋平，罗泽民.虎纹捕鸟蛛毒素-突变体A1Y-HWTX-质谱数据。从该图和图1(a)的比较可以看到,尽管1的固相合成和生物学活性测定[J].中国生物化学与分子生物学两图都出现了目的产物，但是片段缩合法得到的目的报，2000,16(3):357-362.分子量峰远较直接法得到的分子量峰明显,并且含量6] Florsheimer A.et al. Peptides, 1990 ,Proe[A].21* European pep-tide symposium[C]. ESCOM, Leiden:Giralt E & Andreu D, 1991:要高。在图1(c2)中,保留时间为28. 324的峰是目的产物,该峰的面积含量要比直接法高得多,并且很容易[7] Tony Dean. A Practical Introduction to Solid Phase Chemistry筛选出来。[M]. Glaxo Wellcome R &D, 1998:15-16.3.2片段法合成多肽的探讨8] Han So Yeop, Kim Young Ah. Recent development of peptide实验采用的HMPBLinkerf是--种常用的合成coupling reagents in organic synthesis[J] 。Tetrahedron, 2004.(60) :2447-2467.保护片段多肽的连接剂,但是在使用1%TFA切割得Study on Synthesis of Peptide by Segment CondenseNAN Ya-ping(School of Environmental and Municipal Engineering, Xi'ar中国煤化Ire and Technology,Xi'an 710055,Chimc:MYHCNMHGAbstract : Large peptides are synthesized by using two methods: direct synthesis and segment condense. The end-products are analyzed by MS and HPLC. Result shows that segment condense method is more better than direct meth-od. By using this method, the synthesis efficiency and product purity are higher than that of direct method.Keywords: peptide; segment condense; direct synthesis