微藻氮源对红薯原料燃料乙醇发酵过程促进效果的研究

第34卷第9期太阳能学报Vol 34. No 92013年9月ACTA ENERGIAE SOLARIS SINICA2013文章编号:02540096(2013)09154205微藻氮源对红薯原料燃料乙醇发酵过程促进效果的研究申渝3,张海东2,郭劲松3,陈猷鹏3,郑旭煦2,张贤明(L.废油资源化技术与装备教育部工程研究中心,重庆工商大学,重庆400072.催化与功能有机分子重庆市重点实验室,重庆工商大学,重庆400067;3.重庆绿色智能技术研究院,中国科学院,重庆4012)摘要:红薯干粉碎后经双酶法处理得到葡萄糖含量为210.0g/L的醪液,利用工业酸酒酵母 Saccharomycescerevise ATCC6508批式发酵产乙醇。野生水华微藻生物质收集后,经洗涤、稀盐酸水解、干燥、粉碎制得微藻氮源( Algal Nitrogen Source,ANs)。实验发现在未添加任何氮源条件下发酵120h时乙醇浓度为8914g/L,残余葡萄糖为7.0g/L,发酵葡萄糖的乙醇得率为0.4;添加ANS对发酵过程的促进效果显著,当ANS添加量分别为5.010.0和20.0g/L时,发酵终点时间(残余葡萄糖<1.0g/L)分别为96、72和72h,终点乙醇浓度分别为96.198.1和103.0g/L,乙醇得率分别为0.460.47和0.49。蛋白质和氨基酸含量分析表明,ANS和酵母粉蛋白质含量为32.6%和64.5%(干重),游离氨基酸含量为197%和29.9%(干重),高含量的有机氮源特别是游离氨基酸,对发酵效率和乙醇得率的提高有重要作用。对比实验发现;添加10.0g/LANS添加3.0g/L酵母粉的发酵参数相当,因此ANS可替代酵母粉作为红薯原料乙醇发酵的氮源添加剂。关键词:红薯原料;微藻氮源;燃料乙醇发酵;发酵效率;乙醇得率中图分类号:TK6文献标识码:A0引言酵母细胞生长和代谢的必要营养成分,氮源不足会造成发酵速率偏低,甚至发酵停滞,降低乙醇得率和以淀粉为原料生产燃料乙醇工艺成熟、规模化设备生产强度。研究报道表明,添加铵盐、尿素、氨推广风险低,在一段时间内仍是燃料乙醇产业的重基酸、酵母粉等不同种类氮源,均可提高酵母细胞对要发展方向。特别是红薯、木薯为代表的根茎淀粉乙醇的耐受能力,提高发酵效率和乙醇得率,特别是作物,可适应山地等贫瘠土壤单位种植面积淀粉产氨基酸和酵母粉等有机氮源,效果尤其显著9-1)量大,可替代传统玉米等粮食作为燃料乙醇的生产但是有机氮源成本较高乙醇工业发酵过程通常添原料1-4。红薯在我国大部分地区具有广泛的种植加氨水或铵盐作为氮源,尽管如此氮源成本仍是乙基础由于在原料性质和成分上和粮食原料存在较醇生产成本中不可忽略的一部分。大区别需在原料预处理、发酵过程和工艺优化选富营养化水体中以蓝藻为代表的微藻大量快速择微生物菌株适应性等方向作系统的研究工作,并生长造成水华现象进一步恶化水体质量,是当前水以此为基础开发高效原料预处理和发酵生产过程,污染治理中的重要工作之一B,H。尽管采取沉降提升工业过程的经济竞争力-7的方式治理可取得短期效果,但由于多数种类蓝藻红薯的淀粉含量一般为干重的40%~60%,最具有固氮功能,每爆发一次水华就会进一步提高水高可达70%,生长周期较短,是良好的淀粉作物;但体中氮元素的浓度,周而复始;因此唯有采取集中打红薯中蛋白质含量较低,一般占干重的2%,若作为捞的方法将微藻生物质富集的氮元素逐步从水体中燃料乙醇发酵原料必须额外添加氮源。氮源是移除,才是治理水华的根本。集中打捞的大量水华收稿日期:20110728中国煤化工基金项目:国家重大科技专项(2009ZX07104001);重庆市教委自然科学基金(KJ307CNMHG市科委自然科学基金(CSTC2012jB0138)通讯作者:申渝(1981-),男,博士、副教授,主要从事生物质燃料、生化反应工程方面的研究。shenyu@ctbu.edu.cn期申渝等:微藻氮源对红薯原料燃料乙醇发酵过程促进效果的研究1543微藻生物质中蛋白质含量可达干重的20%~35%,比。然后,用1.0mo/L的HCl将初始pH调节至可作为有效的蛋白质资源开发利用,同时可避免处5.0,15℃灭菌20min,冷却至室温,按5%的接种量理不当而对环境造成二次污染。接入液体种子,于30℃恒温摇床发酵,转速为本文将水华微藻生物质加工处理后作为红薯原150r/min。各样品做两次重复样料乙醇发酵过程的外加氮源,并考查其对发酵速率,1.5分析方法乙醇得率以及对发酵过程的影响,为水华微藻生物红薯粉、微藻生物质和酵母粉中总蛋白含量采质的资源化开发做出尝试用微量凯氏定氮仪分析。还原糖含量采用DNs1材料与方法法分析。原料中淀粉含量按照文献[18】所述方法处理之后,通过测定葡萄糖含量折算成淀粉含量。11菌种和培养方法按无菌操作流程从每个三角瓶取出1m醪液,普通工业酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae去离子水稀释后测定葡萄糖、乙醇和细胞浓度。葡ATC6508由大连理工大学生命科学与技术学院白萄糖和乙醇浓度用SBA40Cc生物传感分析仪测定凤武教授课题组赠送,菌种培养保存和种子培养方(山东省科学院生物研究所)。细胞浓度采用显微法参考文献[15]。计数确定1.2微藻氮源制备游离氨基酸和总氨基酸含量分析参考文献[19]野生水华微藻生物质收集后,用自来水洗涤所述流程。称取约0.20g样品,悬浮于1mL去离子2~3遍,过滤后置于85℃烘箱内烘干,粉碎,装入塑水中,沸水浴中溶解100min,然后离心收集上清料袋置于4℃冰箱保存。称取约200g藻粉,放入(1000o/min,5min)用于测定游离氨基酸。氨基酸1000mL不锈钢容器内,同时加入300mL0.1moL浓度采用氨基酸分析仪(日立L8900)。HCl溶液,置于沸水浴中加热搅拌水解2h;用2结果与讨论碎后制得微藻氮源( Algal Nitrogen Source,ANs)装2.1原料主要成分分析入塑料袋置于4℃冰箱保存备用实验中所用的主要原料中蛋白质还原糖和淀1.3红薯糖液制备粉含量如表1所示。红薯粉中还原糖含量约占干重市售鲜红薯洗净切片后烘干,干红薯片粉碎后的758%,其中淀粉含量约为67.5%,占总还原糖过20目筛制得红薯粉。8000mL钢制容器中将红薯的890%,蛋白质含量较低,约为干重的25%。微粉和自来水按1:2.5的比例混合,搅拌加热至85℃藻生物质中蛋白质和还原糖的含量相当,分别为干保温,用1.0mo/LHCl调节pH值至6.0,同时按重的326%和383%。酵母粉中蛋白质含量约占20g/kg(酶粉/红薯粉)加入淀粉酶(北京东华生物干重的64.5%。从分析原料的成分可知野生水华酶制剂有限公司酶活力为4000U1g)搅拌并保温液微藻生物质蛋白含量极高,约为酵母粉的50%,是化2h后将温度降至55℃,按4.0g/kg(酶粉/红薯良好的蛋白质原料。粉)的比例加入糖化酶(北京东华生物酶制剂有限表1红薯粉、水华微藻生物质和酵母粉中主要成分公司,酶活力为50000g),搅拌保温4h。冷却至Table 1 citions of sweet potato powder, bloom室温后用帆布过滤收集糖液,置于-20℃冰箱储存algae biomass and yeast extract powder备用。含量/%干重红薯粉水华微藻生物质酵母粉1.4乙醇发酵蛋白质2.5±0.2326±2864.5±2.1红薯糖液室温解冻后,用自来水将葡萄糖浓度还原糖758±2338.3±1.62.4±0.1稀释到210.0g/L。250mL三角瓶5个,分别装入淀粉150mL红薯糖液,其中3个分别添加5.0、10.0和中国煤化工20.0g/L微藻氮源1个添加3.0g/L酵母粉(北京22乙醇发CNMHG奥博星生物技术有限公司),1个不添加氮源作为对在实验条件完全相同的前提下,添加不同剂量1544太阳能学报34卷的微藻氮源、3.0gL酵母粉和未添加氮源的5组乙条件下生产强度的最高值为1.62g/(Lh),而添加醇发酵实验中乙醇和葡萄糖浓度变化情况如图1所20.0gL微藻氮源(ANS)后最高生产强度可达示。实验表明不添加任何氮源条件下,在120h时未2.50g/(L·h),提高了54%。通过显微计数分析每达到发酵终点,残余葡萄糖浓度为7.0g/L;而添加发酵样品最后的细胞浓度表明,未添加氮源的样品微藻氮源和酵母粉对发酵过程的促进作用非常显著,终点细胞浓度为1.65×10个/m,而添加3.0g/L添加5.0g/L微藻氮源后发酵时间缩短到96h,终点乙酵母粉以及分别添加5.0、10.0和20.0g/L微藻氮醇浓度为96.1g/L,而添加10.0和20.0g/L微藻氮源源的样品终点细胞浓度分别为1.95×103、1.76以及3.0g/L酵母粉之后发酵时间均缩短到72h,终点10°2.01×103和2.35×108个/mL。由于乙醇属于乙醇浓度分别为981、103.0和97.6g/L。初级代谢产物,其生成速率和细胞生长直接关联,因此,外加氮源提高了酵母细胞的生长速率是导致发酵速率和生产强度提升的直接原因之一。802.3微藻氮源和酵母粉氨基酸分析红100文献报道中普遍认为相对于铵盐、硝酸盐等无机氮源以蛋白质和游离氨基酸为代表的有机氮源对酵母细胞乙醇发酵过程的促进作用更加明丰富的有机氮源不但可为细胞的生长代0谢提供必要的营养元素,同时还可提升酵母细胞对发酵时间/h不添加氮源→5 g/L AHBAP亠10 g/L AHBAP乙醇的耐受能力,进而在乙醇抑制的条件下提升细胞的发酵速率。实验分析了微藻氮源(ANS)和图1葡萄糖含量为20.0/L的红薯醒液乙醇发酵添加酵母粉(YE)的游离氨基酸含量分析结果表明,微微藻氮源、酵母粉和不添加氮源对发酵过程的影响藻氮源中游离氨基酸含量为19.7%(干重),酵母粉Fig1 Eifect of algal nitrogen source adding on parameters of中游离氨基酸含量为29.9%(干重)。以游离氨基residue glucose and ethanol concentrations in fuel ethanol酸作为氮源,可直接为细胞生长提供氨基酸成分,减fermentation using sweet potato medium少胞内氨基酸合成,进而减少合成氨基酸过程中产图2中进一步分析各批次发酵过程中生产强度生的NADH,在这种情况下乙醇发酵主要副产物甘(即单位体积发酵液中产物乙醇的生成速率)的变油的产量有所降低,从而提高乙醇的收率叫。通过化情况。由图2可清晰反映出添加氮源之后对设备比较计算不同发酵样品中产物乙醇对葡萄糖的得生产强度的提升效果。整个发酵过程中未添加氮源率,表明未添加氮源样品乙醇得率为0.44,而添加3.0■不添加氮源口5gL3.0g/L酵母粉以及分别添加5.0、10.0和20.0g/LB 1Og/L 020g/L BYE 3g/L微藻氮源样品的乙醇得率分别为0.47、0.46、0.47和0.49,均有一定幅度的提高。蛋白质和氨基酸含量数据表明,微藻氮源和酵901.5母粉蛋白质含量为32.6%和64.5%(千重),游离氨基酸含量为19.7%和29.9%(干重),高含量的有机氮源特别是游离氨基酸对发酵效率和乙醇得率的提高具有重要作用。乙醇发酵实验证明,添加816243240567296120发酵时间h定剂量的微藻氮源可对发酵速率和乙醇得率起到图2葡萄糖含量为210.0g/L的红薯醪液乙醇发酵添加促进和提升作用,因此微藻氮源可替代酵母粉作为微藻氮源、酵母粉和不添加氮源条件下不同时刻的生产强度酵母细胞培养和膨酤訇中国煤化本文只分析Fig 2 Productivities of batches adding algal nitrogen source了微藻氮源中并讨论其对(ANS), yeast extract(YE)and no nitrogen source adding at乙醇发酵过程CNMH所含有的维生different times in ethanol fermentation using sweet potato mash素、矿物质等其他成分同样可能对酵母细胞生长和发申渝等:微藻氮源对红薯原料燃料乙醇发酵过程促进效果的研究1545酵产生促进作用,相关研究尚需进一步系统深入production at laboratory, pilot and industrial scales[J]Bioresource Technology, 2011, 102(6 ): 4573-45793结论[8] Bradbury J H, Hammer BT. et al. pre以酸水解后的野生水华微藻生物质为氮源营quantity and quality and trypsin inhibitor content of养,研究其对红薯原料发酵过程的影响。实验表明sweet potato cultivars from the highlands of Papua New添加微藻氮源可提升以红薯为原料的酵母发酵产乙uinea[J]. Joumal of Agricultural and FoodChemistry,1985,33(3):281-285.醇速率,大幅缩短发酵时间;添加微藻氮源后可促进(9」 Albers E, Larsson C, Liden g,etal. Influence of the酵母细胞生长,提高细胞浓度,这是系统发酵速率提nitrogen source on Saccharomyces cerevisiae anaerobi升的原因之一;同时添加微藻氮源后可增加产物乙growth and product formation[ J]. Applied Environmental醇得率。and Microbiology, 1996, 62(9): 3187--3195[参考文献][10] Bach B, Sauvage F X, Dequin S, et al. Role ofgamma-aminobutyric acid as a source of nitrogen and[1] Srichuwong S, Fujiwara M, Wang X H, et alsuccinate in wine [J]. American Journal Enology anSimultaneous saccharification and fermentation( SSF )ofViticulture,2009,60(4):508-516.very high gravity(VHG)potato mash for the production [11] De Cruz S H, Maffud C E, Emandes Jose R, et alof ethanol[ J]. Biomass and Bioenergy, 2009, 33 (5)tructural complexity of the nitrogen source and influenceon yeast growth and fermentation[J]. Journal of Institut[2] Dai D, Hu ZY, PuG Q, et al. 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Chongqing Institute of Green and intelligent Technology, Chinese Academy of Sciences, Chongging 401122,ChinAbstract: Sweet potato medium contained 210. 0g/L glucose was produced from sweet potato powder based twoenzyme method, and was used for fuel ethanol fermentation by Saccharomyces cerevise ATCC 6508. Bloom algaebiomass was collected and processed into algal nitrogen source(ANS)after processing steps including wash, acidhydrolysis, drying and milling. It was indicated that the residue glucose was 7. 0g/L in batch without nitrogensource feeding after 120h fermentation, and the yield of ethanol and final ethanol concentration were 0. 44 ane89. 14g/L While the fermentation times were reduced to 96, 72 and 72h when 5.0, 10.0 and 20. 0g/L anS wasadded, 96. 1, 98. 1 and 103. Og/L final ethanol concentrations were attained, ethanol yields amounted to 0.46047 and 0. 49 respectively. Protein and amino acid analysis proved that the protein content in ANS and yeast extractwere 32. 6 and 64.5%, and free amino acid content were 19. 7 and 29. 9%, high content of organic nitrogen matterwas expected to be responsible for fermentation rate promotion. The study also indicated ANS was a reliablealternative nitrogen source for yeast extract in ethanol fermentation using sweet potato mash as the medium.Keywords: sweet potato mass; algal nitrogen source(ANS); fuel ethanol fermentation; fermentation efficiencyethanol yield中国煤化工CNMHG