聚乙二醇修饰干扰素α 2b的稳定性研究

聚乙二醇修饰干扰素a 2b的稳定性研究姚文兵,林碧蓉,沈子龙,吴梧桐(中国药科大学生物制药学院江苏南京210009 )摘要:目的研究聚乙二醇修饰干扰素a 2b的稳定性。方法以抗病毒活性为指标考察单修饰干扰素a 2b、多修饰干扰素a2b和干扰素a2b的稳定性(4C、25C、37C)抗胰蛋白酶水解能力和37C人血清稳定性。结果在4C、25C和379C条件下稳定性依次为多修饰干扰素a2b>单修饰干扰素a2b>干扰素a 2b。抗胰蛋白酶水解试验表明:干扰素a2b在30min时抗病毒活性迅速降到原来的7.1%单修饰干扰素a2b剩余50%多修饰干扰素a2b仍保留71%。体外稳定性试验表明在37C人血清放置10h干扰素a2b只保留35%单修饰干扰素a 2b保留71% ,而 多修饰干扰素a 2b仍保留95%的抗病毒活性。结论聚乙二醇修饰可以增加干扰素a 2b的稳定性抗胰蛋白酶水解能力和379人血清稳定性。除了抗胰蛋白酶水解能力修饰度的增加能够明显增强这种作用。关键词:干扰素a2b;聚乙二醇修饰干扰素a 2b ;稳定性;抗中国煤化工中图分类号:Q78文 献标识码:A文 章编号:1005-1678MYHCNMHG收稿日期:2001-07-10;修回日期2001-10-20作者简介;姚文兵( 1962年出生)男生化药学博士主要研究方向为塾萨工程药物的分子修饰天然生物药物的研制中国生化药物杂志Chinese Jourmal of Biochemical Phamaceutics 2001年第22卷第6期93Study on stability of polyethylene glycol-IFN a 2b conjugatesYAO Wen-bing LIN Bi-rong SHEN Zi-long ,WU Wu-tong( School of Bio-pharmaceutics , China Pharmaceutical University , Nanjing 210009 ,China )Abstract Purpose The research was developed to evaluate the stability of polyethylene glycol -IFIN a 2b con-jugates . Methods Anti-viral activity is used as an index to evaluate the thermal stability( at 4C ,25C and37C ) , and the ability of avoiding the trypsin digestion and stability in vitro( at 379C in human serum ) ofmono-PEG-IFN a 2b and poly-PEG-IFN a 2b , then it is compared with IFN a 2b. Results Poly- PEG-IFN a .2b is thermally more stable than mono-PEG-IFN a 2b , and mono- PEG-IFN a 2b more stable than IFN a 2b.The test of anti-trypsin digestion suggests that poly-PEG-IFN a 2b retains 71 % of its anti-viral activity 1 ,mono-PEG-IFN a 2b 50% , IFN a 2b only 7.1 % 30 minutes after being reserved in trypsin solution. Stabilityin vitro indicates that the anti-viral activity of poly-PEG-IFN a 2b is reduced to 95% , mono-PEC-IFN a 2b71% and IFN a 2b 35% 10 hours after being preserved in human serum at 37 C . Conclusion Polyethyleneglycol-IFN a 2b conjugates have improved thermal stability ,ability of protecting from trypsin digestion and sta-bility in vitro . Moreover , the higher the degree of modification , the more stable the IFN a 2b conjugates exceptin the test of anti-trypsin digestion.Key words :IFN a 2b ; Polyethylene glycol -IFIN a 2b conjugates ; Stability ; Anti-viral activity.基因工程药物的药物传递系统一直 是国内外研单层贴壁生长2d以上传代于10%小牛血清RPMI究的热点其中修饰技术的发展相当迅速并且不断1640培养液中生长;冰泡性口腔炎病毒,VSV 病毒,的成熟起来。聚乙二醇修饰技术运用单甲氧基聚乙自行繁殖,- 70C保存。二醇经过活化带上亲电基团,与蛋白质分子.上的亲人血清南京市血站小牛血清杭州四季青生核基团(如自由氨基和末端氨基)共价结合，从而改物工程材料研究所;RPMI 1640 美国Life Technolo-变蛋白质的生物化学性质和药动学性质。据文献报gies公司:胰蛋白酶华美生物工程公司、Serva进口道1]聚乙二醇修饰可以改变蛋白质的稳定性、水溶分装。性、生物活性、体内半衰期和免疫原性。人重组干扰2方法素a2b是一种多功能细胞因子具有广谱抗病毒、2.1 热稳定性抗肿瘤和免疫调节等生物活性,临床上用于治疗慢取干扰素a2b单修饰干扰素a 2b和多修饰干性肝炎和毛细胞性白血病等病毒性疾病和肿瘤。但扰素a 2b溶液，分别于4C、25C和37C放样定时是人重组干扰素a2b不具有天然干扰素的糖基化取样0.3 ml ,- 20°保存。取样时间见表1。同时测结构,生物半衰期短产生中和抗体高,临床应用受定各时间点的抗病毒活性4]。结果以活性保留百分到了限制。前文已经报道231活化聚乙二醇的合数表示。成修饰反应条件的优化和聚乙二醇修饰干扰素a表1热稳定性试验取样时间2b的分离纯化。本文将着重考察干扰素a 2b( IFNa温度(C)取样时间2b),单修饰干扰素a 2l( mono- PEG-IFNa 2b )和多修0.2.4.6、8、10、14、18、24、30 d饰干扰素a 2H( poly- PEG-IFNa 2b )的稳定性从中探250.0.5、1、24.6.810 d索聚乙二醇修饰对干扰素a 2b的作用规律。370、1、2、4、6. 8、12、24、48、72 h _1材料2.2抗胰蛋 白酶水解能力单修饰干扰素a 2l( 1.05x 10° IU/ml 37.5 puf/中国煤化工市干扰素a 2b和多修ml纯度95%以上)多修饰干扰素a 2l(0.63x 106饰干MYHCNMHG0.1%胰蛋白酶溶液IU/ml ,37.5 pμg/ml 纯度95%以上),自制;干扰素a0.8 ml混匀,37C保温,于0、3、5、10、15、30、60、9021( 90 pg/ml ,4. 6x 108 IU/mg )，天津华立达生物工min取样0.1 ml立即与无血清RPMI 1640培养基混程有限公司批号981202。匀以终止胰蛋白酶的作用。取0.1% 空白胰蛋白人羊膜细胞周wish细胞,自行繁殖在培养基中酶溶液0.1ml,用无血清RPMI1640培养基稀释10294中国生化药物杂志Chinese Journal of Biochemical Phamaceutics 2001年第22卷第6期倍，作为空白对照与各时间点的供试品同时测定抗3.1 热稳定性病毒活性4] ,以校正结果。结果以活性保留百分数在4C放置12d干扰素a 2b抗病毒活性只剩表示。9.9% ,单修饰干扰素a 2b的抗病毒活性保留2.3 37°C 人血清稳定性33.5%多修饰干扰素a 2b的活性仍保留91%(图分别取干扰素a2b、单修饰干扰素a2b和多修饰1a)在25C放置4d ,干扰素a 2b的抗病毒活性只干扰素a 2b溶液0.2 ml与处理过的无菌人血清0.8剩14%单修饰干扰素a 2b保留31%的抗病毒活ml混匀37°保温于0、3.6 12、24.36.72 h取样0.3性,而多修饰干扰素a 2b的活性仍有71%(图1b)ml ,- 20C保存。以空白人血清作对照同时测定抗在37°C放置8 h多修饰干扰素a 2b的抗病毒活性病毒活性4]结果以活性保留百分数表示。保留100%单修饰干扰素a 2b为80%而干扰素a3.结果2b2 h只剩下20%(图1c)120R 10010030130 180 Hxoo-D.D5101520253035°24681012u5610152025 30时间/b& 4Cb 25Cc 37C图1干扰素a 2b(-◆-)、单修饰干扰素a2b(-■-)、多修饰干扰案a 2b(-▲-)在不同温度下的稳定性因此聚乙二醇修饰能够在不同程度上增强干1201扰素a2b的稳定性修饰程度的增加可以加强这种00作用尤其在4C。3.2抗胰蛋白酶水解能力在相同的测定条件下胰蛋白酶对干扰素的活性检测并不存在明显干扰。干扰素a 2b在30 min010203040508070800100时抗病毒活性迅速降到原来的7.1%,单修饰干扰时间/min素a2b剩余50%多修饰干扰素a2b仍保留71%。图3干扰素a_b(-◆-)单修饰于扰素a 2b(-■-)、因此聚乙二醇修饰能够明显增强干扰素a2b抵抗多修饰干扰素a 2b(-▲- )在人血清中的稳定性(37C)4讨论耐胰蛋白酶水解的能力。但是修饰程度的增加对这人重组干扰素a 2b是由165个氨基酸组成的单种能力的加强作用并不显著。见图2。链多肽理论相对分子量为19237 D,含4个Cys残12基形成2个分子内二硫键Cys1与Cy98和Cys2910与Cys138其中Cys29 ~ Cys138之间的二硫键对干扰a2b形成特定的立体结构和表现生物活性比较重要。干扰素a2b等电点在5~6之间在pH2.5的溶液中稳定在0. 1% SDS中稳定对热亦稳定对各010203040500708090100种蛋白酶敏感。由人体正常白细胞分泌的干扰素a.时间/mnin2b已经糖基化,但在大肠杆菌中表达的干扰素a 2b图2干扰素 a 2b(-◆-)、单修饰干扰素a 2b(-■-)则未糖基化,且在N末端多一个甲硫氨酸。人重组多修饰干扰素a 2b(-▲-)的酶解稳定性干扰素a2b与天然干扰素a2b的抗病毒活性没有3.3 37 C人血清稳定性明显中国煤化工奏a 2b进行了聚乙二在相同的测定条件下血清对干扰素的活性检醇修MYHCNMHG特征可能会发生某种测没有显著干扰。在379C人血清放置10h,干扰素改变。对聚乙二醇修饰干扰素a 2b的稳定性研究,a 2b只保留35%单修饰干扰素a2b保留71% ,而从一个侧面将有助于理解聚乙二醇修饰对干扰素a多修饰干扰素a 2b仍保留95%的抗病毒活性。见2b理化性质的影响。图3。聚乙二醇修饰干扰素a2b的抗胰蛋白酶水解姚文兵等.聚乙二醇修饰干扰素a 2b的稳定性研究295能力比干扰素a 2b明显增强,这与文献[2]报道一可能具有较长的生物半衰期。致。这可能是由于SC-PEG只能进攻干扰素a 2b分参考文献子里的亲核基团(如自由氨基) ,而含有亲核基团多[1 ] Bailon Ps ,Palleroni AV. Interferon conjugates[ P] . EP 0 809 996，数为各种碱性氨基酸残基(如Lys ,His ,Arg ) ,它们均[2]田北立斤号坯垌笙取7-醇对干扰素a2b的初步修饰1997-03-12.是胰蛋白酶的作用位点。一旦蛋白分子里引入PEG .中国煤化工30( 1)74~ 77.分子作为空间屏障能够阻碍胰蛋白酶的靠近,而[3]林RYHCNMHG醇对干扰素a2b的分离纯.免受水解。化J].中国药科大学学报,2001 ,31( 4)310~ 312.聚乙二醇修饰干扰素a2b的体外稳定性试验[4]中华人民共和国卫生部.中国生物制品规程一部[ M]. -九九比干扰素a2b的明显增强。它与抗胰蛋白酶水解五年版. 北京中国人口出版社,1995 .268 ~ 269.能力试验的结暴居同暗示聚乙二醇修饰干扰素a 2b[5]吴梧桐J锡申,刘景晶.基因工程药物一 基础与临闲M].北京人民卫生出版社,1996. 160.