乙醇脱氢酶法测定血浆中乙醇

西北国防医学杂志( Med NDFNC)2005Oct.26(5)345论著乙醇脱氢酶法测定血浆中乙醇伏建峰史清海路西春高华丁艳萍(兰州军区乌鲁木齐总医院新疆乌鲁木齐830000)摘要目的建立一种快速测定血浆中乙醇浓度的新方法。方法选用三(羟甲基)氨基甲烷盐酸Tris-hcl)作为缓冲体系在碱性条件下乙醇脱氢酶(ADH)催化乙醇转化成乙醛同时生成还原型辅酶I(NADH)在340nm波长处检测吸光度的变化对照标准计算乙醇的浓度。结果ADH最适用量为753KU/L辅酶(NAD+)最适浓度为60.0 mmol检测过程仅需90s线性范围可达0~68.60mmol/L变异系数(CV)为2.31%~3.25%回收率为98.4%~101%与美国DADE试剂盒比较具有良好的相关y=0.985y=0.987x0.024。结论本法测定血浆中乙醇无需除蛋白具有快速简便等优点可用于自动生化分析仪及手工操作适于临床常规运用。关键词:实验室诊断;乙醇;乙醇脱氢酶;检测;临床应用中图分类号:R446.1文献标识码:A文章编号1007-8622(200505-0345-03 Determination of alcohol in plasma by alcohol dehydrogenase method FU Jian--feng, SHI Qing-hai,luxi-cun,etal.( Urumchi General Hospital of Lanzhou Command,pla80000, China) Abstract :Objective To establish a new method for rapid measuring alcohol( ALC)in plasma. Methods: Tri( hydroxymethyl)aminomethane-hydrochloride-(tris-hcl) buffer was used in this study. In the condition of alkalescence alcohol dehydrogenase( ADH )catalyzed the oxidation of ALC to acetaldehyde with the simultaneous production of deoxidized nicotinamide adenine dinucleotide( NADH ) The variance of absorbance was determined by a filter of 340 nm. The concentration of ALC was calculated according to the standard. Results The most adapt quantity of ADH was 753 KU/L and the best concentration of the NAD* was 60. 0 mmol/L. It cost only 90 s in the whole reaction. The range of linearity was from zero to 68. 60mmol/L. The coefficient of variation (CV)in different concentrations was from 2. 31% to 3. 25%. The recovery rate ranged from 98.4% to 101%. Compared with DADE America) reagents method, the regression equation was obtained. Conclusion: This ADH method for measuring the concentration of ALC in plasma is rapid and simple without removing protein. It could be used both automatically and manually and suitable for clinical application. Key wordsLaboratory diagnosis; Alcohol; Alcohol dehydrogenase; Testing; Clinical application饮酒过量可引起以神经精神症状为主的疾病,整个检测过程仅需90s可用于自动生化分析仪及称为酒精中毒(alcohol poisoning)或乙醇中毒(etha手工操作适于临床常规运用 nol poisoning一次饮用大量酒类饮料会对中枢1原理神经系统产生先兴奋后抑制作用重度中毒可使呼选用三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-hl)吸心跳抑制而死亡鉴于酒精中毒的后果严重所作为缓冲体系在碱性条件下,乙醇脱氢酶(ADH)以迅速测定血浆中乙醇浓度对早期诊断和处理急催化乙醇转化成乙醛,同时生成还原型辅酶性酒精中毒具有非常重要的临床价值。作者报道一(NADH)。在340nm波长处检测吸光度的变化对种新的酶终点法测定血浆中乙醇浓度,无需除蛋白,照标准计算乙醇的浓度。2材料与方法收稿期2005-06-23346西北国防医学杂志( Med NDFNC)2005Oct.26(5)ADH16.8mg溶于10ml重蒸水试剂Ⅱnd8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0的Tris-Hcl溶238.8mg溶于6ml重蒸水试剂ⅢTris1070g液结果显示pH10.5时较为适宜同时确定Tris浓溶于100ml重蒸水检测前与0.1mol/LHL按5度为882.9mmol/L:1(V/V)混合。3.5反应动力学曲线:选择低、中、高(17.152.2标准液分别加入100、200、300和4001无34.30、68.6mmol/L)三个不同浓度标准血浆用本水乙醇到50ml蒸馏水中制备出的标准液浓度分法在XL上观察反应进程图2结果表明不同浓度别为17.15、34.30、51.45和68.60mmol/L储存于的样品60s内吸光度上升最快70~80s曲线平缓,具塞容器中备用。90s后吸光度基本一致因此选择90s为反应终点2.3混合血浆制备采集40位健康体检者肘部静时间。脉血各2 ml NaF抗凝离心后制备混合血浆。2.4标准血浆分别加入20、40、60、80μ1无水乙醇到10ml混合血浆中混匀制备出的标准血浆浓度分别为17.15、34.30、51.45和68.60mmol/L,以1ml分装,-20℃储存备用。2.5仪器:XL型生化分析仪(美国杜邦)2.6自动分析参数:反应类型终点法反应温度:37℃波长340mm(主)380nm(次)样品3μl试01003040507081100剂125μl、试剂Ⅱ130ul、试剂Ⅱ340μ反应时图2ADH法检测三个不同乙醇浓度标准血浆反应进程曲线间90s3实验与结果3.6线性范围取浓度为0、17.15、34.30、51.45、3.1ADH用量的选择取ADH(单位KU/L)活性68.60mmol/L的标准血浆用本法测定,乙醇在0~分别为:27、54、108、215、323、430、538、645、75368.60mmolL范围内线性良好860、968的酶工作液分别测定高浓度(51.45mmol/3.7精密度试验选择低中、高(17.15、34.30、L)的乙醇标准液图1结果表明,ADH用量在75351.45mmol/L)三个不同浓度标准血浆用本法重KU/L以上最适。复测定20次批内变异系数分别为3.25%、2.31%和2.40%。3.8回收试验在已知乙醇浓度为20.0mmol/L的标本内分别加入低、中、高三种浓度(17.15、34.30、51.45mmol/L)的乙醇标准液,回收率分别为100%、101%及98.4%3.9干扰试验:将同体积蒸馏水和同体积不同浓度的干扰物分别加入到等体积的混合血浆中前者为对照样品其余为含不同浓度干扰物质的检测样0102003004005006007008000010图1ADH用量的选择/L品每个样品重复测定5次取均值。检测样品与对照样品比较,偏差<±5%说明该浓度物质对检测3.2NA浓度选择在pH10.5、adH为753KU/L无显著干扰。测定结果显示本法至少能去除30条件下观察NAD+浓度(mmol/L)为10、20、3040、mmol/L的乙醛。此外胆红素<500umol/L血红50、60、70、80、90时对反应进程的影响NA+最适蛋白<5g/L、甘油三脂<100mmol/L时测定结果浓度为60.0mmol/L未见明显干扰。3.3缓冲体系的选择配制pH9~11的各种缓冲3.10对比试验选取40份不同乙醇含量的血浆分液甘氨酸-NaOH、h2O4-k2hpO4、naCO3-别用本法与美国DADE试剂盒对比测定结果经回 NaHCO3和Tris-cl等在相同条件下观察其对归分析y=0.985y=0.987x+0.024世租的影响TⅡ1为官111广市仕tT通惯者0西北国防医学杂志( Med NDFNC)2005Oct.26(5)347mmol/36例0.5~1.5mmol/L4例交通管理部门下ADH的最适pH值为10.5送检疑有酒后驾车者27例,血浆乙醇浓度在10.8乙醛是乙醇的氧化产物,其产量增多可抑制~39.0mmol/L平均为21.4mmol/L其中24人最ADH的活性,试验中当乙醛浓度达30.0mmol/L终承认饮过酒酒后反应迟钝并呕吐者8例血浆乙时仍未见其对ADH有明显的抑制作用推测可能醇浓度为20.5~39.7mmol/L酒后昏迷者3例血是Tris-Hcl和乙醛结合生成一种复合物且此反应浆乙醇浓度分别为55.2、59.1和62.8mmol/L不可逆使乙醛迅速被移走反应得以快速进行。4讨论酶法自动分析已经普及血中乙醇的酶学测定ADH法检测乙醇最早由 Hadjiioanno提出并沿法分为两种乙醇氧化酶法和ADH法。乙醇氧化酶用至今,传统方法需除蛋白,且反应时间较长(约法的试剂组成简单缺点是特异性差甲醇对测定干300s)由于乙醇极易挥发很难确保其检测的准确扰很大可出现假阳性。DH法相对特异受甲醇性。本法选择TrisCL作为缓冲体系加之选用或异丙醇的干扰极小5】此外ADH较乙醇氧化酶高活力的ADH促使样品中有限的乙醇快速转化成更易得到且成本较低因此ADH法更适宜常规操乙醛整个检测过程仅需90s且不用除蛋白经方作易于推广应用法学评价各项指标均较为满意线性范围可达0参考文献:68.60mmol/L变异系数(CV)为2.31%~3.5%,[1] Bishop ML, DubenEngelkirk JL, Fody EP. Clinical回收率为98.4%~101%,与美国DADE试剂盒比 chemistry[m]. Fourth Edition, Philadelphia USALippin较具有良好的相关。 cott Williams Wilkins, 2000.508-610.ADH工作环境为碱性,甘氨酸-NaOH、[2]建强刘凤兰血清乙醇脱氢酶活性测定及其临床应用J]天津医科大学学报200171)110-111H2PO4-k2HO4、a2CO3- NaHCO33和Tris-cl[3]陈金来,刘毅,郭妹等酶法血清乙醇测定试剂盒等缓冲体系均可选用。在我们的实验中甘氨酸-的初步评价及临床意义J]天津医科大学学报20028NaOH、KH2PO4-K2HPO4缓冲体系不甚理想(4)506-508.Na2CO3-NaHCO33和Tris-hcl缓冲体系较为理想,[4 Kubota, Hosoki et al. Complete amino acid由于Na2CO3- NaHCO3缓冲液容易结晶不利于存 sequence and characterization of the reaction mechanism of储作者选择Tris-hcl作为缓冲体系,该缓冲体系 glucosamine-induced- novel alcohol dehydrogenase from含有两性离子有利于发挥酶的活力。不同文献报 Agrobacterium radiobacter( tumefaciens)j] Arch Bio-道的ADH的最适pH值也有很大差别范围大致为 chem Biophys,2002,398(2)203-2128.8~10.2-41可能由试验条件及ADH的来源不5]张红霞邓振华谢娜等酒后驾车血液呼气中乙醇同所致作者所选用ADH来自酵母在本试验条件检测方法评价J]刑事技术2003536-39《西北国防医学杂志》征订启事《西北国防医学杂志》为兰州军区联勤部卫生部主办的国、内外公开发行的综合性医药卫生学术性期刊是中国科技论文统计源期刊已被《中国科学引文数据库》等国内重要数据库收录也被美国化学文摘(CA)和俄罗斯文摘杂志(JA)收录,刊出省部级以上各类基金资助论文及获奖论文占有较高比例多次在军内外期刊质量评比中获奖本刊刊登军内外医务工作者有关基础医学、临床医学、军事医学、文献综述、讲座、护理、卫生科技管理等方面的学术文章。主要栏目有述评论著、临床研究、高原医学、经验交流、护理、综述、讲座卫生行政等。我们希望本刊能对广大医务工作者有所神益并热切欢迎对我刊给予扶持和指导。《西北国防医学杂志X前身为《兰后卫生》)1979年创刊2002年改为双月刊大16开本80页逢双月末出版,每期定价10.00元。《西北国防医学杂志》国内邮发代号54101欢迎在当地邮局订阅也可直接向编辑部订阅全年70.00元含邮费)编辑部地址兰州市小西湖西街98号邮政编码730050联系迁(0010750