戊糖和己糖共发酵生产燃料乙醇条件研究

第24卷第2期生物学杂志VoL 24 No. 22007年4月JOURNAL OF BIOLOGYApr 2007戊糖和己糖共发酵生产燃料乙醇条件研究宋安东23王风芹杜风光3耿欣张百良1.河南农业大学生命科学学院郑州4500022.农业部农村可再生能源重点开放实验室郑州450002;3.河南天冠集团南阳473000摘要利用嗜鞣管囊酵母P-01对木糖和葡萄糖共发酵生产燃料乙醇的条件进行了试验硏究結果表明木糖和葡萄糖混合液生产燃料乙醇的最佳条件为发酵液的pH值5.5、30℃、摇床转速120r/min、接种量10%、发酵液初始糖浓度6%、葡萄糖与木糖之比为2、发酵周期为84h。在最佳发酵条件下发酵醪液中的燃料乙醇浓度为2.101%糖醇转化率为35%。关键词木糖葡萄糖洪发酵燃料乙醇中图分类号TQ922文献标识码文章编号1008-963x(2007)2-0017-04利用纤维原料生产燃料乙醇是缓解能源危机、减 philus)P-01,河南农业大学生物工程系筛选菌少环境污染的重要途径之-[3。在纤维质原料的糖种13化液中主要存在己糖(约η0%以葡萄糖为主〕和戊1.1.2混合糖发酵培养基(g100m)混合糖3葡糖(约30%以木糖为主〕两种成分。然而传统乙醇发萄糖:木糖=2:Ⅰ在进行不同起始糖浓度时糖的量按酵中的酒精酵母仅仅可以将葡萄糖等己糖转化成乙具体试验要求称量)酵母浸汁0.3,蛋白胨0.5尿素醇对于木糖等戊糖却不能转化和利用这样纤维糖化0.02,磷酸氬二铵0.01,pH值5.0,于121℃灭菌液中30%的糖类就不能转化成燃料乙醇造成产品产30min备用。率低产品成本高这是严重制约着纤维燃料乙醇工业1.2发酵试验操作化的重要因素。因此解决糖化液中戊糖和己糖共发酵250mL三角瓶中装入发酵培养基50mL接入嗜鞣问题是纤维乙醇生产中的关键问题6]。管囊酵母P-01在不同温度、不同摇床转速、不同接20世纪80年代以来国际上掀起了戊糖发酵以及种量、不同起始pH值、不同起始糖浓度、葡萄糖与木戊糖和己糖共发酵的研究热潮,并取得了很大发糖的不同比例等条件下进行燃料乙醇发酵的单因子影展23。 Taniguchi、 Deng xu、 Olsson等分别对毕赤氏酵响试验和正交试验测定发酵醪液中燃料乙醇的浓度、母、固定化酿酒酵母、重组大肠杄菌Ko1I发酵木糖和葡糖分含量。萄糖混合液的条件进行了研究”南京林业大学用休1.3测定方法哈塔假丝酵母(( andida shehatae)对己糖和戊糖进行共总糖含量用DNS法木糖含量用地衣酚法,葡萄发酵乙醇的条件进行了研究取得了一定的结论∞-H2,糖含量采用总糖含量减去木糖含量乙醇浓度用蒸馏但距离混合糖液产乙醇的理论值还有很大差距。比重法3本文就利用嗜鞣管囊酵母P-01( Pachysolen tan糖醇转化率定义河可发酵性糖转化成燃料乙醇的nophilus)对木糖和葡萄糖共发酵生产燃料乙醇的条件质量百分率。进行了试验研究,为纤维原料生产燃料乙醇的工业化2结果与分析奠定技术准备。2.1pH值对发酵的影响1材料与方法在温度为30℃、摇床转速120r/min、接种量为1材料10%、初始糖浓度为12%、葡萄糖与木糖之比为2不1.1.1试验菌种嗜鞣管囊酵母(Pα uchysolen tan-同p下。贷醚发酵醪液中燃料乙醇中国煤化工收稿日期2006-05-12修回日期2006-11-20CNMHG作者简介宋安东1972-)男河南宜阳人博士副教授硕土生导师,主要从事微生物能源工程等方面的教学和科研工作E-maisongI666@126.com。基金项目国家科技部863)项目(2001AA514020-02)河南省杰出人才创新基金项目(321001300)第24卷第2期生物学杂志VoL 24 No. 22007年4月JOURNAL OF BIOLOGYApr 2007的浓度如图1所示。图1表明发酵液不同的pH值对醪液中燃料乙醇浓度最大为3.966%,此时糖醇转化木糖和葡萄糖共发酵生产燃料乙醇有较大的影响其率为33.1%。中在pH值5.5时发酵醪液中燃料乙醇浓度最大,为3.925%此时糖醇转化率为32.7%。1.72606091201501802转速/r/min图3摇床转速对燃料乙醇发酵的影响ig. 3 Effect of r/min on production of ethanol图1pH值对燃料乙醇发酵试验结果表明戊糖发酵中需要一定的氧气供给of pH on production摇床转动是实验室条件下向微生物供氧的一种方式),2.2温度对发酵的影响即需要微耗氧条件这与戊糖发酵生产燃料乙醇的微生在pH值5.5、摇床转速120r/min接种量为10%、物代谢途径是吻合的。这种条件与传统的己糖发酵生初始糖浓度为12%、葡萄糖与木糖之比为2不同温度产燃料乙醇的厌氧条件不同因此在发酵戊糖时需要给条件下经过84发酵发酵醪液中燃料乙醇的浓度如微生物提供一定的氧气实际生产中可以通过在发酵罐图2所示。图2表明不同发酵温度对木糖和葡萄糖进行搅拌或直接向发酵罐中通入无菌空气实现。共发酵生产燃料乙醇影响很大发酵温度越高发酵醪液中燃料乙醇浓度越大但当温度超过30℃时燃料乙醇浓度随温度升高而明显降低。在28℃和30℃C时2.1661,7RR燃料乙醇浓度相差不大但明显高于其他温度时的燃料乙醇浓度,为3.922%和3.931%此时糖醇转化率为32.7%左右3.923.9接种量/%3.53.D66图4接种量对燃料乙醇发酵的影响Fig, 4 Effect of inoculation on production of ethanol2.4接种量对发酵的影响在pH值5.5、温度为30℃、摇床转速120r/min、初始糖浓度为12%、葡萄糖与木糖之比为2不同的接种量的条件下经过84h发酵后发酵醪液中燃料乙醇浓图2温度对燃料乙醇发酵的影响度如图4所示。图4表明不同的接种量对木糖和葡Fig. 2 Effect of temperature on production of ethanol萄糖共发酵生产燃料乙醇有很大的影响其中在接种2.3摇床转速对发酵的影响量为10%时燃料乙醇浓度最大,为3.959%此时糖醇在温度为30℃、pH值5.5、接种量为10%、初始糖转化率为33%浓度为12%、葡萄糖与木糖之比为2不同摇床转速条2.5初始糖浓度对发酵的影响件下经过84h发酵发酵醪液中燃料乙醇的浓度见图发酵基质的浓度直接影响着微生物生长速度和发3。图3表眀不同的摇床转速对木糖和葡萄糖共发酵酵性能的高低同时也决定了单位发酵设备产量的高生产燃料乙醇有明显的影响控制合适的摇床转速即低。寻求合适的混合液的糖浓度对戊糖和己糖发酵生溶解氧对葡萄糖和木糖混合液共发酵生产燃料乙醇是产燃料Ⅵ凵中国煤化工必要的。随着摇床转速的增大燃料乙醇浓度不断升CNMHG床转速120r/min、接髙在摇床转速为120π/min时燃料乙醇浓度最大,之种量为10%、葡萄糖与木糖之比为2不同初始糖浓度后随着摇床转速的増大燃料乙醇浓度又明显岀现下降的条件下经过84h发酵发酵醪液中燃料乙醇的浓度的趋势。由图3可知在摇床转速为120r/min时发酵如表l所示。由表1可知随着发酵液不同旳初始糖第24卷第2期生物学杂志VoL 24 No. 22007年4月JOURNAL OF BIOLOGYApr 2007浓度的提高燃料乙醇浓度不断升高但分析糖醇转化正交试验的表头设计及试验结果见表24。率方面可以发现P-01较适合于低浓度发酵初始糖表2发酵条件的正交试浓度越高糖醇转化率越低。在初始糖浓度为6%时糖Table 2 Orthogonal experiment醇转化率最大,此时发酵醪液中的燃料乙醇浓度因素H值温度接种量转速燃料乙醇2.035%此时糖醇转化率为33.9%℃)(%)(r/min)浓度(%)表1初始糖浓度对燃料乙醇发酵的影响试验号(A)(B)(C)1(5.0)1(25)1(7)1(90)1.568Table 1 Effect of initial concentration of sugar on production of ethanol2(30)X(10)x(120)2初始糖浓度(%)369121513(35)313)3150)1.234燃料乙醇浓度%)0.9822.0352.9943.9624.1584.2252(5.5)1.957糖醇转化率%)32.733.933.23327.723.52.6初始糖中葡萄糖与木糖之比对发酵的影响234567893(6.0)1.86在pH值5.5、温度为30℃、摇床转速120r/min接种量为10%、初始糖浓度为6%条件下对发酵液中葡8575.35,2294.703萄糖与木糖旳不同比例旳发酵基质进行燃料乙醇的发5,6846.1955.5236.018酵试验经过84h发酵发酵醪液中燃料乙醇的浓度如T2BⅪ5,4084.3695.15.2281.6191.7951.7431.568图5所示。由5可知发酵液中葡萄糖与木糖的比例越大燃料乙醇浓度也越大。由于稻草秸秆糖化液中葡8031.4561.7321.740.2760.60990.498萄糖与木糖的比例基本为7:3这一比例接近于2因此在利用秸秆纤维生产燃料乙醇实际操作中可以采用由表2的试验结果可以看出葡萄糖和木糖的比例为2的发酵条件。(1)在9个处理的直观分析中第5个组合条件下燃料乙醇浓度最高为2.103%其次是第2个组合燃料乙醇浓度为2.055%。从而可以确定第5个组合A2B2C3D2为最佳条件组合。(2)从各个因子不同水平对燃料乙醇浓度的影响来看各个因子影响燃料乙醇浓度的顺序分别是A2>A3>Al、B2>Bl>B3、C.2>C1>D3>D1因此可以确定最佳条件组合为A2B2C2D2这一结果与糖的比例直观分析的结果中仅是C因子即接种量的水平不同图5葡萄糖与木糖比例对燃料乙醇发酵的影响同时也表明了C因子即接种量对发酵结果中燃料乙醇Fig. 5 Effect of ratio of glucose to xylose on ethanol producti2.7发酵条件的正交试验结果浓度的影响是很微弱的。在此确定木糖和葡萄糖共在以上单因子试验的基础上基本确定戊糖和己发酵生产燃料乙醇的最佳发酵条件为A2B2C2D2即糖共发酵生产燃料乙醇的工艺条件为lH值5.5、叫值5.5、30℃、120vmin接种量10%、初始糖浓度为30℃、摇床转速120/min、接种量为10%、发酵液初始6%、葡萄糖与木糖的比是2。糖浓度为6%、葡萄糖与木糖的比例为2、发酵周期为(3)从全局各因子的极差大小RB>R>RA>R84h。为了获得最佳的发酵条件需要对影响燃料乙醇可知在发酵条件中影响乙醇浓度最大的发酵温度其产率的因素进行优化组合试验在实际生产中由于秸次是摇床转速而接种量的影响是最小的。这一结论秆纤维糖化液中的葡萄糖与木糖的比例接近2实际与P-01的生长和发酵特性以及木糖转化燃料乙醇的生产中来调整这两种糖之间的比例的技术难度较大,性质有很好的符合性。所以本试验中不再进行该因素的优化滉外在秸秆纤2.8木糖和葡萄共发酵生产燃料乙醇过程分析维进行糖化时由于原料的吸水性差比重小在糖化用以上试验中木糖和葡萄糖共发酵的最佳条操作中需要用大量的水(原料水=151)在搅拌的状件即凵中国煤化工50L发酵培养基在态下进行糖化所以糖化液中糖的最大浓度为7%兼H值冂 CNMHG最10%、初始糖浓度为之需要相对高浓度发酵的原因因此本试验中不进行6%、葡萄糖与木糖之比为2的条件下对燃料乙醇发酵发酵液初始糖浓度″因素的优化。关于对发酵条件的过程进行分析,发酵过程中糖浓度和燃料乙醇浓度中的温度、pH值、摇床转速和接种量等4个因素进行随发酵时间的变化如图6所示第24卷第2期生物学杂志VoL 24 No. 22007年4月JOURNAL OF BIOLOGYApr 200784h。试验中发现木糖和葡萄糖共发酵生产燃料乙醇的条件中发酵温度和摇床转速是最关键的而接种量和发酵液pH值对发酵的影响不明显。3.2在最佳的发酵条件下发酵至84h发酵醪液中的燃料乙醇浓度达到峰值为2.101%此时糖醇转化率为35%总糖、葡萄糖和木糖的利用率分别为91.1%22436486728寸间/h94.6%和84.1%。发酵过程表明该菌株优先利用葡萄图6木糖和葡萄糖共发酵生产燃料乙醇过程糖并且对葡萄糖的利用较对木糖的利用更彻底。Fig 6 Curve of ethanol production during3.3以木糖和葡萄糖为对象来研究戊糖和己糖共发fermentation of mixture of xylose and glucose酵生产燃料乙醇的条件具有很强的比拟性这一研究由图6可以看出在12h的发酵周期内发酵醪液结论为以后利用纤维原料生产燃料乙醇的实践中解决中的燃料乙醇浓度随着时间的推移而增加在第84h时戊糖和己糖发酵的技术难点奠定技术准备。燃料乙醇浓度达到高峰,为2.101%之后燃料乙醇浓度在一定范围内稍有下降。从表3可以看出在此条件参考文献下糖醇转化率为35%是该条件下理论糖醇转化率的[I]刘仲齐,生物乙醇转化技术的研究进展J]西南农业学报J9991254~6870.47%(木糖的理论醇转化率为47%葡萄糖的理论醇[2] Gregg d saddler J N. Bioconversion of lignocellulosic resi转化率为51.1%混合糖中葡萄糖和木糖的比例为2:1due to ethanol process flowsheet development[ J ] Biomass计算岀该混合糖液理论糖醇转化率为49.668%)nd Bioenergy 1995 9 1-5)287-302燃料乙醇产生的前提基质是可发酵性糖类从图[3 zezodrak Janusz Fiedurek Jan. Technology for conversion o6发现随着时间的推移发酵液中的总糖、葡萄糖和199610(5-6)367~375木糖浓度均不断降低且84h前各种类型的糖下降的[4宋安东张建威吴云汉簿利用酒糟生物质生产燃料乙幅度较大β4h之后糖的浓度下降的幅度明显减小醇的试验研究J]农业工程学报2003194)278-281并维持在一定的水平。从糖浓度的下降与燃料乙醇浓[5 JVon Sivers Margareta Zacchi Guido. Ethanol from lignocel度的升高的关系来看,两者之间有明显的负相关性lulosics a review of the economy[ J ] Bioresource Technolo-∶131~140单独分析总糖中的葡萄糖和木糖的变化可以看出发[6安东.生物质(秸秆)纤维燃料乙醇生产工艺试验研酵伊始葡萄糖浓度的下降比木糖浓度的下降幅度大究D]河南农业大学博士学位论文2003说明P-01对葡萄糖的利用较多而对木糖的利用较[7Jahn- Hagerdal B Jeppsson H Skoog K et al. Biochemistry即P-0在共发酵葡萄糖和木糖形成燃料乙醇的and physiology of xylose fermentation by yeasts[ J Enzyme过程中优先利用葡萄糖。Microb. Technol. 1994, 16 933-943[8 JHugh G, Lawford Joyce D Rousseau Ali Mohagheghi, et结合图6和表3的结果发现在发酵醪液中的残糖aL. Continuous fermentation studies with xylose -utilizing re中木糖的浓度较葡萄糖的浓度大說明P-0对葡萄糖ombinant Zymomonas mobilis[ J]. Applied Biochemistry的利用比对木糖的利用彻底;其中总糖的利用率为d biotechnology. 2000 84-86 295-30991.1%葡萄糖和木糖的利用率分别为96%和84.1%,[9 1J C du Preez. Process parameters and environmental facters也说明了葡萄糖的利用比木糖的利用更容易、彻底。fecting D-xylose fermentation by yeast[ J Enzyme Mcrob Technol 1994 16 943-955表3木糖和葡萄糖共发酵生产燃料乙醇分析表[10强余世袁洪枫等.氧对亚硫酸盐制浆废液戊Table 3 Analysis of ethanol production by mixture of glucose and xylose糖、己糖同步酒精发酵的影响[J].林产化学与工业发酵时燃料乙醇总糖浓葡萄糖浓木糖浓糖醇转化总糖利用葡萄糖利木糖利用h)浓%)%)度%)唐%)率%)率%)用率%)率[l肠杨斌吕燕萍高孔荣等.蔗渣水解液发酵乙醇的研842.1010.5360.2170.3193究J]生物工程学报19971X4)380~386.3小结[12]王瑞明关凤梅马霞等.玉米秸秆水解与木糖酒精3.Ⅰ通过对P-01共发酵葡萄糖和木糖混合液生产发中国煤化工2291)56-58燃料乙醇的条件的试验研究結果表明共发酵木糖和[13环CNMHG木糖为原料的酒精发酵⊥x以(自然科学版)200318葡萄糖生产燃料乙醇的最佳条件是发酵液的pH值(3):1~435.5、30℃、摇床转速120r/min、接种量10%、发酵液初[14福亭.农业试验设计与统计分析M]北京浓村读始糖浓度6%、葡萄糖与木糖之比为2、发酵周期为物出版社1993(下转62页)第24卷第2期生物学杂志VoL 24 No. 22007年4月JOURNAL OF BIOLOGYApr 2007用与展望J]湖北植保2004131~35[12张瑞福戴青华何健籌等.七株有机磷农药降解菌的[4崔中利李顺鹏.化学农药的微生物降解及其机制J]降解特性比狡J]中国环境科学200424(5)584江苏环境科技199831-55成春鄅养浩刘用凯,环境微生物降解有机磷农药研[13玲.降解有杋氯农药的微生物菌株分离筛选及应究进風J]上海环境科学20032x(12)863~868用效果J]应用生态学报20001(2)249~252[6张卫虞云龙吴加伦等.阿维菌素在土壤中的降解[14]王国惠,有机氯高效降解菌的筛选及其降解能力的研和高效降解菌的筛逝J]土壤学报20041(4)590究J]环境保护20048:2-15.[15]薛庆节闰艳春.基因工程技术在降解农药中的应用7胀张承东韩朔暌卢颖.不同土壤中苯噻草胺的微生物[J]20042X(增刊):73-175降魟J]农业环境保护2001203):52-154.[16]仪美芹王开运姜兴印等.微生物降解农药的研究进[8j曹志方王银善.甲胺磷农药的微生物降觚J]环境科展J]山东农业大学学报2002334)519~52学进展1996K6)32~35[17杨小红李俊葛诚等.微生物降解农药的研究新9史延茂堇超赵芓等.甲胺磷农药的微生物降解进J]微生物学通报2003306)93[J]河北省科学院学报.200320(3)179-182[18 MArgaret S M, lan R H. Quantification of acetochlor degra[10程国锋李顺鹏沈标等.微生物降解蔬菜残留农药dation in the unsaturated zone using two novel in situ field研究J]应用与环境生物学报1998A1)81~84.techniques comparisons with laboratory generated data and11阮少江刘洁赵永芳籌,微生物降解甲胺磷农药的进腻J]宁德师专学报200012(3):77~180Manag sci200157(4)351-359Novel advances on pesticides degradation by microorganismsLI Yan JIANG Ji-zhi IU Cui -fangCollege of Life Sciences, Hebei University, Baoding 071002, ChinaAbstract: Pesticides especially chemical pesticides with high toxicity high residue and difficult degradationare kinds of important environment pollutants. Pesticides degradation by microorganisms is one of the powerfulmeans to treat pesticide pollution. The types of pesticides degradation construction of genetically engineered micro-organisms degrading mechanisms degradation characteristics influencing factors applying effects and some others were summarized in this paper. The research advance of degradation of pesticides by microorganms andlems to be solved were also put forwarKeywords: pesticides microbial degradation influencing factors上接20页)Studies on conditions of co-ferment hexose and pentose to fuel ethanolSONG An-dong 23, WANG Feng-qin, DU Feng-guang', GENG Xin, Zhang Bai-liang1. Henan Tianguan Group, Nanyang, 473000 China 2. Life Science College, Henan Agricultural UniversityZhengzhou 450002, China ;3. Key Laboratory of Rural Renewable Energy, Ministry of Agriculture, Zhengzhou450002 ChinaAbstract: Conditions of co-ferment hexose and pentose to fuel ethanol by using Pachysolen tannophilus P-01were studied. The result showed that optimal conditions of converted mixture of xylose and glucose liquid to fuelethanol as follows: pH5. 5 30C the rotation speed was 120r/mir中国煤化工, initial concentrationof total sugar 6%o the ratio of glucose to xylose was 2 and the ferCNMH GurS. The yield of fuelthanol concentration and the conversation of sugar to ethanol were 2. 101% and 35 respectively under optimalfermentation conditionKeywords: xylose glucose ,co-ferment fuel ethanol