甲醇降解菌的分离及性质研究

第11卷第3期生物技术Vol.11 ,No.32001年6月BIOTECHNOLOGYJun 2001中图分类号:Q93 - 331文献标识码:A .文章编号:1004- 311X( 2001 )3- 0021- 03甲醇降解菌的分离及性质研究宋志文'陈冠雄' ,马放2杨基先2( 1.中国科学院沈阳应用生态研究所辽宁沈阳110016 ;2.哈尔滨工业大学黑龙江哈尔滨150001 )摘..要对氮肥厂活性污泥进行驯化筛选得到 3株甲醇降解菌,可耐10 00mg/L左右的甲醇浓度实验得出其最佳生长条件为pH7~ 8、温度30C~ 35C、通气,在适宜条件下对甲醇有较好的降解能力。关键词:甲醇降解菌驯化生物降解甲醇作为一种有机污染物广泛存在于基测定0OD5so吸收值。本有机合成、塑料、人造纤维、制药、离子交换1.5 细菌计数采用平板菌落计数法7]。树脂、石油化工、林业化工及硫酸盐纸浆等生1.6 申醇的测定采用气相色谱法岛津GC产废水中[1。甲醇对人体和水生生物和微生- 102型气相色谱仪分析,检测器为FID ,检物均有毒性1。对于甲醇废水的处理主要有测器、进样口、色谱柱的温度分别为170°C、物理化学处理方法和生物处理方法231。由190C、180C高纯N2作载气填料为GDX -于申醇的生物可降解性极大,因而生物处理10260目~80目)方法就显得更为重要456。较高浓度的甲醇对细菌有毒害作用,从而影响处理效果。2结果与分析分离和筛选降解甲醇的高效菌株，是这类废水生物处理的重要环节。本研究采用驯化的2.1 菌株鉴定分离出3株可以以甲醇为唯方法筛选出对甲醇有较强降解能力的菌株,一生长 碳源降解甲醇的细菌编号为PI、P2为此类废水的工业化处理提供微生物基础。P3根据细菌的菌落特征个体形态,生理生化反应,按文献8鉴定为假单胞菌属细菌1材料与方法( Pseudomonas sp :2.2菌 株的适宜生长条件1.1 培养基2.2.1甲醇浓度对细菌生长的影响1.1.1 牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏3g/L取3种菌株母液各1ml 分别加入到含有蛋白胨5g/L葡萄糖4g/L氯化钠5g/L琼脂不同浓度甲醇的100ml 选择培养基中,置摇20g/L pH7.0~7.2。床中反应72h,取反应液进行细菌平板菌落1.1.2选择培养基:K2HPO40.5g/L计数。结果见表1。KH2PO40.5g/L MgSO40.3g/L ( NH4 )SO4表1甲醇浓度对细菌生长的影响. 1.0g/L微量元素液10ml ,pH7.0- 7.2 ,加入.甲醇浓度P1细菌数( 10 )P:( mg/L)一定量 甲醇。1.1.3 微量元素液配方:ZnSO40.2g/L、FeS-93.4.4.54.13.3187.64.73.93.7040.5g/L CaCl23 .0g/ L MnSO40.06g/I。1.2菌种的驯化将从某氮肥厂得到的活性403.53.8污泥加到含100ml/L 甲醇的选择培养基中，773. 92.72.9之后每天按2倍比例加入甲醇,至甲醇浓度.1357.82.62.1为12800mg/L将菌液转移到新配制的选择3074.30.40.210.18培养基中，重复驯化2次后_取0.2ml菌液在6418.90.090.0120.07牛肉膏蛋白胨培养基上涂平板32C恒温培12134.50.0330.0041.3生长条件 :考察不同甲醇浓度、温度、二从表1中可以看出,3种菌株对甲醇均pH、供氧状况、氮源及尿素含量对细菌生长表现出较强的耐受性,当甲醇浓度在93.4mg/L~ 1357 .8mg/L时,细菌数量保持在的影响。1.4 细菌密度测定:以空白培养基作对照,106数量级随着甲醇浓度的提高,细菌数有所下降,在甲醇浓度高达12134 . 5mg/L时仍收稿日期2001 - 01- 02 ;修回日期2001-04- 03有一定数量的菌株存活。作者简介宋志文( 1966- ),男博士生工程师,从事工2.2.2培养时间对细菌生长的影响:取3种业废水的生物处理、环境微生物学研究发表论文4篇。菌株母液各1ml 分别加到含有甲醇200mg/LpH7.0的100ml 选择培养基中329C摇床22生物技术第11卷第3期培养,每隔一定时间取样测反应液0ODo值，329培养箱和 120r/min摇床上培养72h后，结果见图1。 .取样测定0OD5so值结果见图4。0350.4[0.33t0.25口静置■振荡)2 F80.150.10.051224364860728496108时间(b)PP2蘭株图1培养时间对细菌生长的影响从图中可以看出3种菌株的生长曲线图4供氧状况对细菌生长的影响不同,P1、 P2、P3进入稳定期的时间分别为从图中可以看出振荡培养的细菌生长明60h、36h和36h ,在稳定期持续的时间分别为显好于静置培养的细菌说明分离的菌株生36h、24h和36h。长要在好氧条件下进行,因此在实践中应用2.2.3培养温度对细菌生长的影响:取3种.这些菌株处理甲醇废水或进行甲醇污染的现菌株母液各1ml 分别加到含有200mg/L 甲场修复需要保持良好的通气(曝气条件,否醇、pH7.0的选择培养基中在不同温度下摇则将影响菌株的生长。，床反应72h测反应液ODso值结果如图2所2.2.6不同氮源对细菌生长的影响:取3种示。结果表明3株细菌均为中温菌,在159 .菌株母液各1ml,分别加到含有不同氮源的~40C范围内温度对细菌的生长影响相对氮源培养基中在适宜条件下培养72h取样测定ODs5结果见图5。结果表明,3株细菌较小最适生长温度为30°C~35°C。的最佳氮源是牛肉膏,P1 和P3的次佳氮源2.2.4 培养基初始pH对细菌生长的影响:是尿素P2的次佳氮源是硝酸铵。取3种菌株母液各1ml分别加到含有200mg/L甲醇、不同pH的100ml选择培养基中置圈P10P2于摇床中32C条件下反应72h结果见图3。OP30.4 [0.20.350.15P30尿素硫酸铵 硝酸铵.硝酸钠牛肉膏图5不同氮源对细 菌生长的影响1520 2530 3510 温度2.2.7_尿素含量对细菌生长的影响:取3种.菌株母液各1ml 分别加到含有不同含量尿.图2培养温度对细菌生长的影响素的100ml选择培养基中,在适宜条件下反应72h取样测定0OD6o值结果见图6。.).25 [0.→P1-P2--P0:。00.4P 0.389pH0.5图3培养基 pH对细菌生长的影响尿素含量(%)从图中可以看出3株菌生长的最适pH为7~8 ,P1对pH比P2、P3更敏感过酸或过图6尿素含量对细菌生长的影响碱均不利于菌体生长。从图中可以看出,低含量尿素( 1% ~2.2.5供氧状况对细菌生长的影响:试验是2%)对3种菌株的生长均有很大的促进作以摇床培养作为好氧静置作为缺氧条件进用。在氮肥厂合成氨生产过程中产生的甲醇行的取3种菌株母液各1ml分别加到含有废水中通常含有少量的尿素[9。从实验结果200mg/L用数糖l7.0的选择培养基中,在来看1%~2%含量的尿素可作为细菌生长第11卷第3期生物技术Vol.11 ,No.32001年6月BIOTECHNOLOGYJun 2001的氮源促进细菌的生长。P3进入稳定期的时间分别为60h、36h和2.3降解甲醇的能力36h在稳定期持续的时间分别为36h、24h和取3株细菌母液各1ml分别加入到含有36h 3株细菌的最适生长条件为_pH7 ~ 8、不同浓度甲醇的100ml 选择培养基中,在适30°C ~ 35°C、振荡培养,最佳氮源是牛肉膏_宜条件下反应12h测定甲醇含量,计算甲醇少量尿素(1%~2%对细菌生长有很好的促降解率结果见图7。进作用在适宜条件下，当甲醇浓度< 300mg/100L时3株细菌对甲醇降解率均很高,经12h降解率在80%以上。随着甲醇浓度加大降80解能力也随之降低,在低浓度甲醇条件下3株细菌对甲醇的降解能力基本相同,在高浓度条件下,P1对甲醇的降解效果明显好于P2、P3。根据菌株的性质有可能将其投加到活性污泥或生物膜中处理甲醇废水，从而为甲醇废水的生物处理提供微生物学基础。笔93 188 40.4 77.4 135.8 307.4 641.9 1213.5者将分离筛选的菌株固定在颗粒活性碳(ZJ甲醇含量(m/L)- 15 )上处理轻度污染甲醇废水取得了一 定效果10]图7细菌对甲醇的降解能力参考文献:从表中可以看出在甲醇浓度< 300mg/L[1I苏JM.格鲁什科.工业废水中有害有机化合物手册时3株细菌对甲醇降解率均很高,在80%以[MI北京化学工业出版社: 1988 208 -211.[2冯锡康主编。有机化工废水治理技术[ M].北京:化学上。随着甲醇浓度加大,降解能力也随之降[3赵洪波.国内甲醇废水处理技术应用现状[J]化工环工业出版社低在低浓度甲醇条件下3株细菌对甲醇的保,1998 ,18(6):154~ 157.降解能力基本相同,在高浓度条件下,P1 对[4 Novak J T C D ,Benoit，et al . Biodegradation of methanol and甲醇的降解效果明显好于P2、P3。tertiary butyl alcohol in subsurface systems[ J ] Water Sci._Technol.1985 ,17 71~ 85.[ 5 ]Anthony C.The _oxidation of methanol in gram - negative bacte-3结论nid J ] FEMS Microbiology Reviews. 1990 87( 3-4 ):209~ 214.[ 6 ]Kinagata K. Systematics of methanol - utilizing bacteria[ J ].从氮肥厂活性污泥中分离出3株能够以7 BMicrobicly Reivcs9087 3-4)0122出甲醇为唯一碳源降解甲醇的细菌，编号为[7祖若夫等，微生物学实验教程M jP1、P2、P3经鉴定均为假单胞菌属细菌，这3版社,1993 :株细菌可在10 000mg/L的甲醇浓度中存活。;8中国科学院微生物研究所细菌分类组编著.一般细菌常用鉴定方法M 1.北京科学出版社1978 :135 ~ 194试验表明3种菌株的生长曲线不同,P1、P2、: 9国家环境保护局石油石化工 业废水治理M].北京:中国环境科学出版社.1992 :461 - 535[10宋志文陈冠雄,马放。微生物固定化处理甲醇废水的实验研究J]微生物学杂志2000 244 )30~31.Isolation and characterization of bacteria capable of degradingmethanolSONG Zhi- wen' CHEN Guan- xiong' ,MA Fang2 ,YANG Ji - xian2( 1. Institute of Applied Ecology Academia Sinica Shenyang 110016 ;2. Harbin Institute of Technology Harbin 150001 China )Abstract :Three strains of bacteria which can highly degrade methanol have been obtained by enriching ,screening and acclimatizing the strains in active sludge gotten from a fertilizer factory . These bacteria cantolerate methanol of 10 ,000mg/L ,The optimum culture conditions are pH7 ~ 8 30C ~ 35C and aera-tion. At th5op麴据n conditions their degrading capacities are very efficient.Key words imethanol degrading bacteria jacclimatization ;biodegradation