乙醇对角质酶性质的影响

研究论文乙醇对角质酶性质的影响王莉,王淼k」,2(1.江南大学食品学院,江苏无锡214122:2,食品科学与技术国家重点实验室,江南大学,江苏无锡214122)摘要:研究了乙醇溶液对角质酶性质的影响,同时用圆二色光谱和荧光光谱法对经过硫酸铵沉淀、镍柱亲和层析等方法获得的电泳纯角质酶进行了构象研究。结果表明,在体积分数40%30%和20%乙醇溶液中角质酶催化反应的最适温度分别为50、55和65℃;在37℃下,酶在体积分数20%~50%乙醇中具有较妤的稳定性,体积分教30%和40%乙醇对角质酶具有激活作用;角质酶在体积分数30%和50%乙醇中催化反应的最适pH分别为9.5和9.0;在体积分数30%乙醇溶液中角质酶的pH稳定范围为6.5~10.5。角质酶在50℃的乙醇溶液中的失活动力学研究表明,角质酶的失活属于一级动力学反应(R2>0.98)。从角质酶构象的研究结果可以看出,在乙醇体系中角质酶的二级结构和三级结构都发生了相应的变化,关键词:角质酶;乙醇;酶学性质;构象中图分类号:Q814.9文献标识码:A文章编号:1673-1689(2012)01-033-07Effect of Ethanol on the property of CutinaseWANG Li, WANG Miao“l2(1. The School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China: 2. State Key Laboratory of FoodScience and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122. China)Abstract: In this manuscript, effect of ethanol solutions on the biochemical property and conformation of cutinase were studied. The results showed that the optimum temperatures of cuti-nase were 65C, 55 C and 50 C respectively in 20%(V/V), 30% and 40% ethanol solutions.In 20% and 50% ethanol solutions cutinase was stable at 37C. In 30% and 50% ethanol solu-tions the optimum ph of cutinase were 9. 5 and 9. 0 respectively. In 30% ethanol solution theph stability range of cutinase was 6.. 5. In 30% and 40% ethanol solutions activity ofcutinase at 37 C was enhanced. The inactivation kinetic of cutinase was researched in ethanolsolutions at 50C. The results showed that the inactivation kinetic of cutinase in ethanol solu-tions followed the first order reaction(R2>0. 98). And the secondary and the tertiary structureconformations greatly changed in ethanol solutiods.Key words: cutinase, ethanol, enzymatic property, conformation生物酶作为高效的生物催化剂,传统意义上是的催化反应已经倍受关注,酶学领域也有了一个全在水溶液中进行的,但是,目前对其在有机溶液中新的分支一非水酶学(21。通常认为在极性溶剂中中国煤化工收稿日期:2011-03-23基金项目:国家自然科学基金项目(20776063);国家计划863项目(2011AA100905)CNMHG通倌作者:王森(1962-),女,江苏无锡人,工学博士,教授博士研究生导师,主要从事食品生物化学方面的研究Email:mwang@jiangnan.edu.cn食品与生物技术学报2012年第32第1期WANG LI, et al, Effect of Ethanol on the Property of CutinaseResearch article酶的稳定性较差,大部分非水相酶反应均被限制于13试验方法相对非极性的溶剂中。一方面非极性溶剂利于提1.3.1pNPB水解酶活力的测定分光光度法。高酶的稳定性,另一方面,在非极性溶剂中酶易于酶活在20℃下测定,反应体积为1mL,其含20μL保持其活性构象而表现出高的催化活力。极性有酶液、50mmol/L对硝基苯丁酸酯和50mmol/L硫机溶剂会争夺酶分子表面的结构水,使酶失活。因磺脱氧胆酸钠pH为80的缓冲液980μL。在405此,对酶在有机溶剂中性质及稳定性的研究主要集mm记录对硝基酚的生产速率。酶活定义:20℃下,中与非极性溶剂中3,4。每分钟催化对硝基苯丁酸酯水解1μmol对硝基酚角质酶是一种可以降解角质并产生大量脂肪的酶量为一个酶活力单位口1。酸单体的水解酶,是a/B水解酶家族中相对分子质1.3.2酶的分离与纯化将发酵液于4℃量较小的成员,其活性中心含有典型的催化三元组10000r/min离心20min去除菌体,上清液经质量Ser1o、His1、Aspn5),具有酯酶和脂肪酶的功分数50%的硫酸铵盐析,4℃、1000r/min离心能。角质酶可降解不溶性甘油三酯、可溶性酯和20min,得沉淀并透析,经0.45m的滤纸微滤,然角质等聚酯,也能破坏角质多聚物分子的酯键使其后经镍柱进行亲和层析得纯酶制品。水解为单体和小分子寡聚体6-。它作为一种多功1.3.3蛋白质含量测定福林酚法。能水解酶,在食品、化工及纺织等诸多领域都具有L3.4 SDA-PAGE分析分离胶质量浓度为12广泛的应用g/dL,浓编胶质量浓度为2.5g/dL,电泳采用pH目前,国内关于角质酶的研究较少,国外对角8.3的 Tris-HO1缓冲体系,电泳后用考马斯亮蓝质酶的研究大多集中于酶学性质结构以及生产菌G250染色株构建、以及酶在反胶束体系中的性质及应1.3.5角质酶性质的研究角质酶性质研究采用用10-12,虽然有研究表明角质酶在体积分数75%硫酸铵分级沉淀、透析后的粗酶液。乙醇中20℃下放置18h活力基本不丧失1,但并1)角质酶在乙醇溶液中的最适反应温度以未对酶在乙醇体系中的性质进行系统研究。乙醇NPB为底物,用不同体积分数乙醇溶液(20%、在工业中被广泛应用,是一种良好的有机溶剂许30%40%50%)配制pH8.0、20mmol/L的缓冲多食品原料中功能性成分的提取都是用乙醇作为液代替NPB水解酶活测定方法中的缓冲液,在不溶剂的,研究角质酶在乙醇中的催化性质,将有助同温度下(37~70℃)测定酶的剩余活力,以天然酶于扩大角质酶的应用范围。活力为100%确定该酶在不同体积分数乙醇溶液中的最适反应温度。材料与方法如派潮2)角质酶在体积分数30%和50%乙醇溶液中1.1实验材料的最适反应pH值分别用体积分数30%和50%角质酶发酵液:作者所在实验室提供;对硝基的乙醇溶液配制不同pH值(6.0~11.0)的缓冲液,苯丁酸酯(pNPB)、硫磺脱氧胆酸:购自 Sigma公代替pNPB水解酶活测定方法中的缓冲液在其最司;其它试剂均为分析纯试剂。适反应温度下测定酶的残余活力,以天然酶活力为12实验仪器100%,研兖酶在体积分数30%和50%乙醇溶液中ARB120电子天平:尤尼柯上海仪器有限公司最适作用pH。所用的缓冲液体系是用体积分数产品;AB204N电子天平:上海森信实验仪器有限30%和50%乙醇溶液配制,分别为:20mmol/L磷公司产品;EL20型pH计:梅特勒托利多仪器有限酸缓冲体系(pH6.0~7.0);20mmo/ L Tris-HCl公司产品; Backman Coulter(USA)台式冷冻离心缓冲液体系(pH7.5~9.0);20mmol/L磷酸氢二机:上海力申科学仪器有限公司产品;V-1800型可钠-NaOH缓冲体系(pH9.5~11.0)。见分光光度计:上海美谱达仪器有限公司产品;F3)角质酶在Z醇溶溏中的热稳定性为了研7000荧光光谱仪:日本日立公司产品;MOS450兖该酶的中国煤化工夜(20%、30%,AFCD圆二色光谱仪:法国 Bio-logic公司产品。40%、50%CNMHG一定比例分别与不同体积分数乙醇溶液配制的pH8.020mmol/G Journal of Food Seence and Bloteehnolot Vol32 No. 1 2012研究论文」王莉,等:乙醇对角质酶性质的影响L. Tris-HCI缓冲液混合在37、45、50和55℃保温,9.75%,以上各步的纯化结果如表1所示。每隔一定时间取出部分酶液,立即在冰浴中冷却,按pNPB水解酶活力测定方法测定残余酶活4)角质酶在体积分数30%和50%乙醇溶液中的pH稳定性将酶在37℃、不同pH值(pH6.0~11.0)的缓冲液中放置12h,每隔一段时间取出部分酶液,按pNPB水解酶活力测定方法测定残留酶活。缓冲液体系同1.3.7。5)酶在乙醇溶液中的失活动力学将酶液按定比例分别与体积分数20%、30%、40%、50%乙醇溶液配制的pH8.0、20mmol/ L Tris-HCI缓冲液混合,在50℃下放置一定时间,每隔一定时间取Lane 1: Purified cutinase; Lane 2: Molecular weight marker(A出部分酶液,按pNPB水解酶活力测定方法测定残97400;B.66200C,43000D,3100余酶活。图1pNPB水解酶的 SDS-PAGE凝胶电泳根据 Arrhenius方程lnA=-kt和lnk=lnknFig. I SDS-PAGE of cutinase(E/RT)计算失活动力学参数。其中A是酶活,U/ml;T是绝对温度,K;E是活化能;t12是半衰表1角质酶纯化过程参数期,min;t是保温时间,min;R是气体常数,8.314Tab. I The parameters of cutinase purification510J/(K·mol);k是速率常数,1/min纯化总酶活/U收总蛋自质/比酶活/纯化过程1.3.6角质酶在醇溶液中的构象圆二色光谱检U/mg)倍数:将纯化后的样品溶解于pH8.0、20mmol/Ll的粗酶液37384.40100.001965.9519.021.00Tris-HCl缓冲液中室温放置30min,立即冰浴;样盐析37111.9599.27975.4538.052.00品溶解于体积分数30%、50%乙醇溶液配制的pH透析36858.6498.59896.06·41.132.168.0、20mmol/L.Tris-HCl缓冲液中,各自分别在镍柱层析3646.689.7531.36116.286.1237℃、50℃下放置30min,立即冰浴。蛋白质质量浓度为0.1mg/ml。测定远紫外区(190~250nm22角质酶在乙醇溶液中的性质CD谱,扫描速度1nm/s,重复5次。圆二色谱用平2.2.1乙醇体积分数对角质酶最适反应温度的影均椭圆度[0]表示,单位为度·厘米2分摩尔(deg响温度是影响酶催化作用的主要因素之一,一方dmol面随着温度的升高,化学反应速度加快,另一方面cm荧光光谱检测:样品处理方式同圆二色光谱检高温会使酶变性失活,有机溶剂的加入也会影响酶测。荧光扫描采用F7000FL型分光光度计,激发反应的最适温度。因此,需要通过实验确定酶在有波长为280mm,发射波长为290~450nm15-20。机介质中酶催化的最适温度,以提高酶催化反应速率2结果与分析在不同体积分数乙醇溶液中,角质酶的最适反2.1角质酶的分离纯化应温度也不同,且不同于酶在正常情况下的最适作用温度60℃。由图2可知,体积分数20%、30%将含有角质酶的发酵液通过硫酸铵分级盐析、和40%乙醇溶液中,酶的最适反应温度分别为透析、镍柱亲和层析进行分离纯化,纯化表见表1,得到的样品通过 SDS-PAGE凝胶电泳检测只显现65℃、55℃和50℃,且当乙醇体积分数低于40%时,出一条谱带,说明纯化的角质酶已达到电泳纯(图角质酶的催化中国煤化工度中,该体系1)。纯化后pNPB水解酶比活力从19.02U/mg提对角质酶具有G%乙醇溶液NMHG高到1128U/mg,纯化倍数为6.12,回收率为中的酶活力最高可再版下时2倍,当乙醇体积分数达到50%时,酶活力显著降低。有研究表明食品与生物技术学报2012年第32卷第1期⑤WANG Li, et al: Effect of Ethanol on the Property of CutinaseResearch article上述现象可能是由于适当体积分数的乙醇改变了酶50℃55℃的构象,从而使酶分子更有利于与底物接触进行催化反应,当乙醇浓度过高时,它对酶构象的改变超出了酶的承受能力使酶变性,酶活力下降甚至失活2。20%一-30%一40%—50%→套6080100时间min(b)-37℃45℃12050℃3540455055606570图2不同体积分数乙率角质蔺的最佳反应温度Fig 2 Optimal temperature of cutinase in ethanol solutions2.2.2角质酶在乙醇溶液中的热稳定性研究角质酶在乙醇溶液中热稳定性研究表明(见图3)。在体积分数20%乙醇溶液中,45℃以下酶活基本保持时间/min不变,酶相对稳定。温度高于45℃时,随着温度的升高,酶的稳定性显著降低(图3(a));在体积分数-37℃12030%乙醇溶液中,37℃时酶稳定性较好,在此条件下保温100min后,残余酶活仍比在缓冲液中的原始酶活高。但在45℃下酶的稳定性有所下降,且随着温度升高酶稳定性快速下降(图3(b));当乙醇体积分数为40%~50%时,酶只在37℃具有较好的20热稳定性(图3(c)、(d)。这说明酶在高体积分数时间的乙醇溶液中,只有在低温下具有较好的稳定性角质酶在水溶液中40℃下保温70h,残留酶活仍图3角质确在乙醇溶液中的热稳定性abcd分别为角在80%以上;在60℃时半衰期为42h。,与此相质酶在体积分数20%、30%40%和50%乙醇中的热比在乙醇溶液中热稳定性有所下降。乙醇是与水稳定性)互溶的极性溶剂,会与酶争夺水分子,甚至剥除蛋Fig.3 Thermostability of cutinase in ethanol solutions a白质分子的“必需水”层,扰乱酶分子天然构象的形(20%),b(30%),c(40%)andd(50%)成,在乙醇存在的条件下,高温更易使酶变性,从2.2.3角质酶在乙醇溶液中的最适pH值由上而使酶在醇中的稳定性降低。述研究结果可知角质酶在体积分数30%乙醇溶液中的催化活性最高,当乙醇体积分数大于30%时,37℃-45℃12050℃55℃角质酶的催化活性下降,达到体积分数50%时只在10037℃下有一定的稳定,选择研究体积分数30%和8050%乙醇中角质酶的最适反应pH值具有代表性。60前人研究表明,角质酶在水溶液中的最适pH8.01,乙施晶活nH值的影响如图4所20示,角质酶中国煤化工H值发生了20406080100时间/m改变,在体NMHG液中的最适反应pH值分别为9.5和9.0,在体积分数30%乙醇30 Journal of Food Science and Biotechnology Vol 32 No. 1 2012研究论文王莉,等:乙醇对角质酶性质的影响溶液中pH8.0~10.0范围内酶活变化不大,但均pH6.0H95pH11.0H80—0pH10.5比在水溶液中有大幅提高,当pH为9.5时,最大活150pH6.5H7.0力是水中的2.45倍。很多研究表明酶在有机介质中催化反应的最适pH值通常与酶在水溶液中反应的最适pH值接近或相同,这主要是针对非极性有机溶剂而言,乙醇是与水互溶的极性溶剂,它对角质酶的激活效应有待进一步探讨体积分数30%乙醇体积分数50%乙醇时间h(b)图5角质酶在体积分数50%(a)、30%(b)乙醇中的pH稳定性Fig 5 pH stability of cutinase in ethanol solutions (a)(50%)and(b)(30%)2.2.5角质酶在乙醇溶液中的失活动力学为了进一步探索分析不同体积分数乙醇对角质酶活力的影响,作者对50℃下角质酶的失活动力学进行图4角质酶在体积分数30%、50%乙醇中的最适反应pH值研究,不同乙醇体积分数下角质酶的失活动力学曲Fig.4 Optimal pl of cutinase in ethanol solutions线见图6所示2.2,↓角质酶在乙醇溶液中的pH稳定性由角体积分数20%乙醇质酶在乙醇溶液中最适反应温度和温度稳定性可体积分数40%乙醇知,37℃时角质酶在体积分数50%以下的乙醇溶一体积分数30%乙醇一体积分数50%乙醇液中都具有一定的稳定性,且角质酶在体积分数30%乙醇溶液中活性最高;从角质酶在乙醇溶液中最适反应pH的研究结果可知,角质酶在体积分数50%乙醇溶液具有一定的酶活,且乙醇作为一种食55品级的有机溶剂,高体积分数的乙醇在工业中被广泛应用,因此研究角质酶在体积分数50%乙醇中的H稳定性是有必要的。角质酶在乙醇中的pH稳定性如图5所示,在体积分数50%乙醇溶液中,角质酶的pH稳定性较差,短时间内,在pH6~7的范围内时间/min有一定稳定性,当pH到9.0时,酶的稳定性迅速下图6角质酶在醇溶液中的失活动力学曲线降(图5(a)),而在30%乙醇溶液中,角质酶较稳定,rg.6 Inactivation curves of cutinase in ethanol solutionspH稳定范围为pH6.5~10.5(见图5(b)。从图6可以看出,角质酶的失活反应基本符合150pH6.0一级反应动力学的规律,利用 Arrhenius方程可以pH 6.5计算出各种失活动力学参数,结果如表2所示。120pH8.0从表2可以看出,随着醇体积分数的增大,酶-pH9.0的失活速率常数增加,失活的活化能下降。角质酶在体积分数20%乙醇溶液中半衰期为71.63min,而在体积分数溶中其半期迅速下降到5.23min中国煤化工会很快失活681012CNMHG时间h酶失活的活性有关,E。越大角质酶越稳定,由此也可以看出随着醇体积分数食品与生物技术学报2012年第32卷第1期6WANG Li,et al: Effect of Ethanol on the Property of CutinaseResearch Article的增大,角质酶的稳定性在下降。条件下角质酶的荧光强度。蛋白质在340nm左右表2角质酶在醇溶液中的失活动力学参数的荧光强度主要与蛋白质分子中Trp和Tyr残基Tab.2 The inactivation kinetic parameters of cutinase in eth-的暴露和解离的程度有关221.荧光发射光谱的anol solutions变化与生色基团的微环境等多方面因素相关。由失活速率活化能半衰期此推测,角质酶在37℃下30%乙醇中三级结构发体积分数/%常数kE()生了有利于催化活性的变化0.009617636.07表3角质酶分子构象中各结构单元含量0.053112997.2213.89Tab 3 Secondary structural compositions of cutinase0.105611106.916.86处理方式螺旋/%折叠/B转角卷曲0.118610712.082.2.6角质酶在醇溶液中的构象上述研究表明30%乙醇、37℃9.2445.8810.8433.94角质酶在37℃体积分数30%的乙醇溶液中具有较30%乙醇、50℃55.663.4019.4220.52高活性,且有较好的稳定性,为此,作者对角质酶的构象进行了研究。图7是角质酶在不同温度下、不50%乙醇、37℃9.1145.9510.9133同体积分数的乙醇溶液中放置30min后测得的圆50%乙醇、50℃9.3245.7910.7234.17色图谱。-30%37℃缓冲液50%37℃37℃30%缓冲液37℃50%50%50℃30%50℃50℃30%210N50℃50%2300320350380410440波长/nm波长/图7不同方式处理后角质酶的圆二色光谱图8不同方式处理后角质酶的荧光发射光谱图Fig. 7 Circular dichroism spectrums of cutinase incubatedig. 8 Fluorescence intensity of cutinase incubated 30min in30min in different waysdifferent ways从图了可以看出:在不同体积分数的乙液【结语件分析,得出角质酶在不同体系中α螺旋、β折叠、B1)角质酶在低体积分数的乙醇溶液中的催化转角及无规则卷曲的比例(见表3)。从表3的数据性质发生了变化。20%、30%、40%乙醇溶液中的可以看出,酶的相对活力与其二级结构之间没有明最适温度分别为65、55、50℃。热稳定性研究表显的相关性。因此作者采用荧光光谱法对酶蛋白明,在37℃下,酶在体积分数20%~50%乙醇中都的三级结构进行进一步的研究。图8是不同体系具有较好的稳定性。中角质酶的荧光发射光谱,角质酶在336~342nm2)角质酶在体积分数30%和50%乙醇中催化处有一特征荧光发射峰,但在50℃下、体积分数反应的最适pH分别为9.5和9.0。在30%乙醇溶50%乙醇中角质酶的荧光发射峰位红移至342m,液中角质酶的pH稳定范围为65~10.5;在50%其他条件下角质酶的荧光发射峰未发生位移,只是乙醇溶液中中国煤化工荧光强度不同,对于活力较高的37℃下30%乙醇3)角质CNMHG的失活动力学中的角质酶,在336m的荧光强度明显低于其他研究表明,角质酶的失活属于一级动力学反应(R6> Journal of Food Science and Blot echnology Vol32 No. 1 2012研究论文王莉,等:乙醇对角质酶性质的影响>0.98)。活性没有明显相关性,但与三级结构有很大的相关4)用CD光谱法和荧光光谱法对电泳纯的角质性,且角质酶在37℃下30%乙醇中三级结构可能酶进行构象研究表明,角质酶的二级结构与其催化发生了有利于催化活性的变化参考文献( References)1]陈晟,陈坚,吴敬.一种嗜热细菌来源角质酶的分离纯化及酶学性质[冂].应用与环境生物学报,2009,15(6):846-850CHEN Sheng, CHEN Jian, WU Jing. 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