聚乙二醇衍生物修饰胰蛋白酶的研究

第29卷第3期南京师大学报(自然科学版)Vol. 29 No. 32006年9月JOURNAL OF NANJING NORMAL UNIV ERSITY( Natural Science )Sep 2006聚乙二醇衍生物修饰胰蛋白酶的研究董伟吴进刘红杨生涛王伟伟(南京理工大学化工学院江苏南京210094 )[摘要]采用各种类型的聚乙二醇衍生物修饰胰蛋白酶对所修饰酶的酶学性质进行了评价并与原酶比较.结果表明修饰酶的残存活力受修饰剂的结构、分子量和修饰化度的影响较大其中分子量为5000或6000的2种聚乙二醇衍生物所修饰的酶活力升高.所有修饰酶的热稳定性显著改善其最适pH值没有发生变化修饰酶的Km值有所增加.实验表明采用合适的修饰剂对胰蛋白酶进行适度地修饰不会降低酶的活性和改变酶性能.[关键词]聚乙二醇衍生物胰蛋白酶化学修饰. [中图分类号]Q814 [文献标识码]A [文章编号]1001-4616( 2006 )03-0053-05Studies on the Modification of Trypsin with Polyethylene Glycol DerivativesDong Wei , Wu Jin , Liu Hong , Yang Shengtao , Wang Weiwei( School of Chemical Engineering , Nanjing University of Science and Technology , Nanjing 210094 , China )Abstract :Trypsin was modified by a series of PEG derivatives , then the properties of modified enzymeswere evaluated and were compared with native enzyme. The results show that the activity of modified en-zymes depended on the structure ,molecular weight of PEG derivatives and the degreed of modification ,and the activity of enzyme modified by PEG derivatives( M = 5000 or 6000 ) was enhanced. The thermalstability of all modified enzymes was improved significantly. The modification does not change the opti-mum pH value of trypsin. The Km values of the conjugates are slightly higher than the native enzyme. Thtemperate modification did not reduce enzyme' s activity.Key words PEG derivatives , trypsin , chemical modification化学修饰作为提高多肽、核酸和多糖等生物分子的临床和生物学性能的重要手段得到日益广泛的研究和应用.化学修饰的效果好坏很大程度上取决于化学修饰剂的性能优劣.在众多的化学修饰剂中聚乙二醇Polyethyleneglycol,PEG)及其衍生物由于具有线性、无毒、无免疫原性以及良好的生物相容性等优良性能而在化学修饰中应用最广泛聚乙二醇对蛋白质的化学修饰已被证明具有颇多优点通过对蛋白质实施PEG化降低了其免疫原性和体内清除的速率延长了其在体内的半衰期增加了蛋白质的溶解性和热力学稳定性以及抗蛋白酶降解的能力(21.胰蛋白酶(Trypsin)以蛋白酶原的形式存在于动物胰脏中,-般从牛、羊和猪胰脏中提取,它能够催化水解碱性氨基酸的羧基所形成的肽键、酰胺键和酯键.国外的科研工作者关于胰蛋白酶的化学修饰已经做了不少研究.Elsner等人用小分子物质修饰胰蛋白酶实现胰蛋白酶的胍基化和琥珀酰化考察化学修饰对酶催化行为和稳定性的影响,Gaertner 等人41使用氰尿酰氯活化的单甲氧基聚乙二醇( mPEG ,CH3O-PEG-OH)和对硝基苯酚氯甲酸酯活化的mPEG(mPEG-NPC)作为修饰剂并对修饰酶进行了表征;Zalipsky等人S1使用PEG - ss(聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯)和PEG - CS(羧甲基化聚乙二醇琥珀酰亚胺酯)修饰胰蛋白酶,比较了两种修饰剂的优劣.本研究工作是采用分子量为2000-10000的4种不同类型的PEG修饰剂来修饰胰蛋白酶,详细探讨各种修饰剂对中国煤化工响并测定修饰酶的YHCNMH G收稿日期:006.04-17.7基金项目:江苏省高校高新技术发展资助项目(JHB04-037).作者简介:董伟,1964-副教授主要从事蛋白质化学修饰和阳离子聚合物基因传递系统的教学与研究.E-mail : dvmailcn@ yahoo. com. cn一53一南京师大学报(自然科学版)第29卷第3期(2006年)修饰化度、酶活、热稳定性、pH稳定性和K,(米氏常数)值研究胰蛋白酶的酶学性能变化进而评价所合成的各种修饰剂.1材料和方法1.1 材料单甲氧基聚乙二醇( mPEG )N-羟基琥珀酰亚胺( NHS )L-赖氨酸、2 4 6-三硝基苯磺酸钠( TN-BS)N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐( BAEE )均购于美国Sigma公司;PEG4000 ,PEG60(化学纯)购于广州化学试剂经营批发部进口分装);N N-二环己基碳二亚胺( DCC )购于东京化成工业株式会社胰蛋白酶购于美国Invitrogen公司考马斯亮蓝G250购于Fluka公司牛血清白蛋白( BSA )购于上海化学试剂公司其它试剂均为国产市售分析纯试剂.1.2 聚乙二醇衍生物的合成按文献方法分别合成了PEG - SA , mPEG - SA(61 ,mPEG - CA[7]和BmPEC814种类型的聚乙二醇衍生物各种类型衍生物结构式如图1.PEC -SA:mPEG- -SA:0H0OC-CH2CH2-C-0-PEG-0-C-CH2CH2-C00HmPEC- -0-C-CH,CH- COOHBnPEG:mPEG-CA:mPEG-OCH2CONHmPFC- -0CH2C00H(CH2).HC-C00HmPEG-OCH.CONH图1 各种类型PEG衍生物结构式为了使所合成的PEG衍生物能够在较温和的条件下直接修饰蛋白质或酶避免修饰过程中蛋白质的高级结构的破坏和活性丧失需进行活化使其与NHS和DCC反应形成琥珀酰亚胺活性酯.这样上述PEG -SA ,mPEG - SA mPEG - CA和BmPEG就转变成相应类型的蛋白质修饰剂PEG - ss. mPEG - Ss. mPEG -CS和BmPEG - Lys - NHS.以mPEG - CA转变为mPEG - CS为例来说明末端羧基活化的过程如下:mPEG0CH.COOH ~NHS> mPEGOCH,C-O-N'DCCmPEG- CAmPEG-CS1.3 胰蛋白酶的化学修饰.称取一定量的胰蛋白酶(5mg)溶于5mLpH9.3硼砂-氢氧化钠缓冲溶液中配制酶浓度为1mg/mL加入一定量活化聚乙二醇修饰剂在常温下( 20-25 C )磁力搅拌反应4 h.所加入的修饰剂量与胰蛋白酶分子中可被修饰的氨基量成-定的摩尔比.为了使修饰反应能够充分进行,反应中PEG修饰剂用量充分过量, PEG修饰剂: NH2 =5:1(摩尔比)胰蛋白酶中可被修饰的氨基为15个,即PEG修饰剂: Tryp-sin=75: 1.1.4修饰酶的纯化采用透析法进行蛋白质纯化透析液为pH=8.2 Tris- HCl缓冲液透析在4 C下进行.透析袋规格为D36 mm、截留分子量8 000 - 14 000.1.5 修饰酶的蛋白质浓度的测定采用Bradford 检测法°]测定蛋白质浓度.中国煤化工1.6 胰蛋白酶修饰化度测定MHCNMHG采用三硝基苯磺酸钠(TNBS)法来测定胰蛋白酶修饰化度10].取1.0mL0.01%(W/V)TNBS水溶液至1.5mLTris-HCI(pH8.2)缓冲溶液中混合均匀后作为参比;另取两只试管分别加入1.0mLTNBS水溶液随后依次加入1. 5 mL胰蛋白酶和修饰酶(蛋白浓度均为0. 25 mg/mL)混合均匀后室温下静置30一.54董伟等聚乙二醇衍生物修饰胰蛋白酶的研究min后在420 nm处测定吸光度值.1.7 胰蛋白酶酶活性测定11]为简单起见,本文只测定其相对酶活的变化,即比活力的变化.测定胰蛋白酶酶活时采用的底物为N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐( BAEE );用0. 10 mol/L pH=8.0 Tris- HCI缓冲液(内含10 mmol/LCa2+ )配制0. 5 mmol/L BAEE底物溶液.1.8胰蛋 白酶及修饰酶的热稳定性的测定选择了两个温度( 37 C 60 C )来衡量酶修饰前后热稳定性的变化具体操作方法如下确定原酶与修饰酶的浓度均为0.5mg/mL将其放入相应温度的恒温箱中每隔一定时间取出酶液室温下测定其酶活力最后将测得的各个时段的酶活与各自修饰酶恒温前的初始酶活相比较计算出经过不同时间后的酶活力残存百分比,从而可以比较热稳定性的变化.1.9pH值对胰蛋白酶及修饰酶活性的影响选取不同pH值( 5. 0、6.0、7.0、8.0、9. 0.9.5和10 )的底物溶液并配制1 mg/mL的酶溶液测出在上述不同pH值条件下的酶活力,以最适pH值条件下的酶活力为100%,计算出该酶在其余pH值下活性残留百分比观察酶活性随pH值的变化趋势并比较原酶与修饰酶的最适pH值变化情况.1.10胰蛋白酶及修饰酶Km值的测定米氏常数Km值的测定采用双倒数作图法( Lineweaver-Burk法y121.2结果与讨论2.1酶的活性残存 与修饰化度关系在相同摩尔比的反应条件下不同类型修饰剂修饰胰蛋白酶所得到的修饰化度是不同的酶的残存活力也不相同.修饰酶的活力和修饰化度的关系如图2所示.值得强调的是，当亲电的PEG修饰剂和亲核的氨基发生取代反应时胰蛋白酶分子中游离的氨基都有可能被修饰,此过程属于随机修饰测得的修饰化度为平均修饰化度.从图2中可以看出胰蛋白酶被同-种类型的修饰剂修饰后其修饰化度随着修饰剂分子量的增加而降低,例如:PEG4000-ss-Trypsin修饰化度为51.0%而PEG6000-ss-Trypsin修饰化度则为24.4% .修饰化度对修饰酶活力影响较大.选择合适的修饰剂、进行适度的修饰,可以使胰蛋白酶的活力升高过度修饰会降低酶的活性.图中结果显示PEG6000-ss-Trypsin和mPEG5000-ss-Trypsin的酶活力比原酶的活力高而其它修饰酶的酶活力比原酶低.分析原因适度的修饰不但不会影响底物与酶活性中心的结合反而因其对酶构象的稳定并使酶对外部环境的适应性增强使酶的活性有所提高但也有可能是因为修饰使其具有更活泼更易催化的构型.修饰化度愈大修饰剂在胰蛋白酶分子表面形成的屏障愈突出对底物与活性位点结合的阻碍作用愈大使得酶的活性有所降低.120[口Relaive activitySSSS Degree of modifcation00望8(i 60出4020中国煤化工ABDIFYHCNMHG日2 胰蛋自酶及其修饰酶的活力、修饰化度关系A. Native Trypsin B. PEG4000- ss -Trypsin C. PEG6000 SS-Trypsin D. mPEG2000-SS -Trypsin E. mPEC5000 SS-TrypsinE. mPEG2000- CS-Trypsin G. mPEC5000- CS -Trypsin H . 2mPE2000-Lys-Trypsin I .2mPEGS00-Lyst -Trypsin-55一南京师大学报(自然科学版)第29卷第3期(2006年)2.2胰蛋 白酶热稳定性变化考察了原酶与8种修饰酶的热稳定性变化-- Native Trypsin .趋势.从实验数据看经过化学修饰以后胰蛋白10→- PEG6000 SS-Trypsin酶的热稳定性有了显著提高.但不同类型的修饰-4- mPEC5000-SS -Trypsin剂对胰蛋白酶热稳定性的改善程度是不一样的;-▼mPEG5000-CS- -Trypsin而同一类型不同分子量的PEG所修饰的胰蛋白◆2mPEC2000-Ly-Trypsin50 t酶的热稳定性没有太大的差别.为清晰可见每种类型修饰剂选择1个将其在37 °C热稳定性变◆化趋势绘于图3中.从图中可以看出热稳定性的顺序如下:20下=XBmPEG> mPEG - CS> mPEG -SS> PEG .-SS>原酶胰蛋白酶及其修饰酶在60C下的热稳定性变03405060Time/h化规律也是一致的.放置0.5h后活力残留数图337C下胰蛋白酶及其修饰酶的热稳定性据见表1.胰蛋白酶偶联PEG链后维持了蛋白质的天然构表160C下原酶 与修饰酶热稳定性数据象增强了蛋白质的刚性从而改善了胰蛋白酶的热稳定性.Relative activity/%2.3 pH值对酶活性的影响Enzymeafter 30 min at 60 C具体的各酶在不同pH值下活力变化情况见图4.从图~ Native Typsin中可以看出胰蛋白酶经过聚乙二醇衍生物修饰后其酶的PEC400 -Ss -Typsin4.6最适pH值并没有发生变化其最适pH值保持在pH =PEG6000 - ss - Trypsin7. 5mPEG2000 -Ss - Trypsin12. 38.0在这一pH值下不管是原酶还是修饰酶都具有最好的mPEG5000 - ss - Trypsin11.7催化活性.在pH值小于8.0的溶液中原酶与修饰酶的活mPEC2000 - cS - Trypsin14. 5力变化趋势几乎一样修饰酶并没有表现出比原酶更好的mPEG5000 - CS - Trypsin18.52mPEG2000 - Lys - Trypsin .37. 9耐酸性;但是在pH值大于8.0时修饰酶活力下降趋势比_2mPEG5000 - Lys - Trypsin19.7原酶要慢,体现出较好的耐碱性.2.4胰蛋白酶修饰前后 Km值的变化依照双倒数作图法求出胰蛋白酶及其修饰100酶的Km值其数值见表2.80表2胰蛋白酶及修饰酶的Km值Km/( mmo/L) .--. Narive TrypsinTrypsin .0. 023-●-PEG6000-SS-TrypsinPEC4000 - ss - Trypsin0. 032-▲ - -mPEG5000-SS Trypsin0. 044mPEG2000 - ss - Trypsin0. 03720-▼V- - mPEC5000-CS-Trypsin0.039◆2mPEG2000-Lys-TrypsinmPEG2000 - CS - Trypsin0.028mPEG5000 - Cs - Typsin0. 0342mPEC2000 - Lys - TrypsinpH2mPEG5000 - Lys - Trypsin0.063围4不同 pH值条件下胰蛋白酶及修饰酶活力残存百分数从表2中可以看出胰蛋白酶经各种修饰剂修饰以后其米氏常数K.值均有不同程度的增加这可近:似表明修饰酶对底物的亲和力较原酶小由于聚乙二醇与蛋白质相偶联在蛋白质分子的表面形成---个柔性的屏障在-定程度上阻碍了底物与活性中心的结合,即酶对底物的亲和力降低;但是在蛋白质分子表面偶联.上PEG分子，又增加了蛋白质表面的亲水性从而酶中国煤化工是高.因此可以发现与原酶的K值相比,虽然修饰酶的Km值增加,但幅度并不是YHCNMHG的应用.在修饰酶中,2mPEG5000 - Lys - Trypsin的Km值最大这可能与它的结构和分子量有关.这种酶是分枝型的聚乙二醇所修饰的,它比线性修饰剂所形成的屏障更大;并且其分子量也最大所具有的链更长,因此对底物与活性位点结合的阻碍更大.- 56董伟等聚乙二醇衍生物修饰胰蛋白酶的研究3结论采用各种类型的聚乙二醇衍生物修饰胰蛋白酶.从修饰的结果可以看出修饰酶的残存活力受多种因素影响其中修饰剂的结构、分子量及酶的修饰化度对修饰酶的残存活力影响显著,但各种修饰酶的热稳定性显著改善这主要取决于修饰剂的结构与其分子量的大小关系不大;其最适pH值并没有发生变化;由于偶联PEG修饰酶的Km值有所增加.通过对修饰酶的酶学性质的表征,比较得出分枝型修饰剂2mPEG和mPEG-CS修饰蛋白质性能优于可降解的PEG-ss和mPEG-Ss.[参考文献][ 1 ] Koumenis I L , Shahrokh Z. 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