乙二醇/丝素蛋白共混膜的研究

Journal of Silk第50卷No23213年09月第09期研究与技术o:10.3969/j.issn.1001-7003.2013.09.001乙二醇/丝素蛋白共混膜的研究钱巧芬,张珊珊,侯静,吴琪,卢神州(1.苏州大学纺织与服装工程学院,江苏苏州215123;南通苏州大学纺织研究院,江苏苏州215123)摘要:将丝素蛋白水溶液和乙二醇混合,制备透明丝素蛋白共混膜。用X射线衍射、红外光谱法对共混膜的结构进行分析,并测定其溶失率、学性能及透光率,考察了其酶降解性能。在透明膜上培养L929细胞并对其黏附率和增殖进行测定,察其生物相容性。研究表明:乙二醇能诱导丝素蛋白由无规结构向 Silk结晶结构转变,并且共混膜的溶失率得到了极大的改善,透光性良好。当乙二醇质量分数为30%时,共混膜柔韧性最好。试验表明,透明丝素蛋白膜具有较好的生物降解性,能够很好地支持角膜成纤维细胞在其上的黏附与增殖,细胞相容性良好。关键词:丝素蛋白;透明;乙二醇;膜中图分类号:TB383文献标志码:A文章编号:1001-7003(2013)09-0001-06 Study on Ethylene Glycol/Silk Fibroin Blend Membrane (1. College of Textile and Clothing Engineering, Soochow University, Suzhou 215123, China; 2. Nantong Textile Institute of Soochow University, Suzhou 215123, China) Abstract: This study blends aqueous solution of silk fibroin and ethylene glycol and prepares transparent silk fibroin blend membrane; analyzes the structure of the blend membrane with X-ray diffraction and infrared spectroscopy nd investigates its enzymatic degradation property; cultures L929 cell on the transparent membrane, measures its adhesion rate and proliferation and investigates its hat ethylene glycol can induce silk fibroin to transform from disordered structure into Silk crystal ne has been greatly improved; it has a good light-admitting quality. When the mass fraction of ethylene glycol is 30%, the blend membrane has the best flexibility. The test shows that transparent silk fibroin membrane has a good biodegradability and cytocompatibility and can well support the adhesion and proliferation of fibroblast on it Key words: silk fibroin; transparent; ethylene glycol; membrane几个世纪以来,蚕丝作为一种纺织材料,因其特级和纳米级的丝素纤维、丝素膜、丝素水凝胶、多孔殊的光泽和良好的机械性能而广为人知。蚕丝能材料、球状骨针、胶囊等3一般认为,丝素蛋白除被溴化锂硫氰酸锂硫氰酸钙、氯化钙等的浓溶液了无规卷曲结构,还存在 Silk和SilkⅡ两种结晶结溶解(21,从而加工成其他形态的材料,如直径为微米构。研究表明,湿热法、有机溶剂法和拉伸处理法能够促使丝素蛋白从无规卷曲向B-折叠结构转变4,收稿日期:201303-11最终使得丝素蛋白材料不溶于水。得益于其良好的基金项目:国家自然基金(1203107):南通市科技计划项目生物相容性,很多种类的细胞能在丝素膜上生长(BK2012095)教育部留学回国人员科研启动基金资助项目人角膜内皮细胞可以在丝素膜上生长,表明丝素膜(K510212作者简介:钱巧芬(1989),女,硕士研究生,研究方向为可以用于角膜移植人角膜成纤维细胞在丝素膜丝素蛋白材料。通信作者:卢神州,副教授 lushenzhou@及丝素多孔材料上培养结果表明,丝素蛋白材料对 suda.edu.cno角膜组织的修复有重大的利用价值。但是丝素溶1第50 Journal of Silk液直接浇铸在基质上,待液体挥发并最终转变为固1.3溶失率测定相,得到的丝素膜脆性较大,强度不够,且易溶于将共混膜在恒温恒湿(25℃,相对湿度65%)下水,使其应用于角膜的修复受到限制。因此,如何平衡24h,每个称取质量W1(g)的样品3块然后在改善丝素蛋白膜的水溶性及透明性,使其更加符合烘箱中105℃烘至恒重。称重得到W2(g)。含水率人角膜移植的要求是目前角膜组织修复的一个热C的计算公式:点。目前有些文献采用丝素蛋白与其他化合物或天C/%=1-W2×100(1)然高聚物共混合来改善其水溶性及生物相容性。W丝素蛋白溶液与山梨醇或肌醇共混,可以制备出不将共混膜在恒温恒湿(25℃,相对湿度65%)环溶于水的透明丝素膜101,但是两种共混膜只能在干境中平衡24h,然后准确称取0.1g左右的样品W1,态下保持较好的透光率,在湿态时透光率不理想,使放入锥形瓶中,按浴比1:100加入去离子水,37℃水其在角膜修复工程上的应用受到了限制。因此,需浴预热30min后在37℃的水浴恒温震荡器中震荡24h,然后取出溶液。用 Smartspec型紫外分光光度要寻求一种醇类化合物,在将其与丝素蛋白混合后,计测出溶液在278nm下的吸光度A。共混膜的丝素共混膜在干、湿态都能保持良好的透光率。蛋白溶失率D计算公式:将一定比例的聚乙二醇混入丝素膜可使膜在保持原有良好生物性质前提下改善膜的柔韧性,且透D/%xv(1-C)W×100(2)光性较好,但因其聚合物相对分子量较大,故与丝素式中:K为丝素溶液的紫外吸光常数,K=1.1026的可混性稍差。因此,本文考虑采用相对分子量剩下的丝素膜固体用去离子水冲洗3遍后放入较小的乙二醇,与丝素共混的方法制得丝素蛋白透105℃烘箱中烘干得W2。共混膜的质量溶失率Z计明共混膜,对其结构和性能进行了研究,并在其上培算公式:养L929细胞,研究其生物相容性。%(1-C)×W1-W2100(3) (1-C)1试验与方法1.4力学性能测试1.1丝素蛋白共混膜的制备使用美国 Instron3365型万能材料试验机进行测家蚕生丝置于质量分数为0.05%的Na2CO3溶试,拉伸速度为20mm/min,夹距为28mm,试样是按照GB/T10402006标准工字3型刀具压出的样条。液中,于98~100℃处理30min,重复3次,脱去生丝测试干态强力前将样条在恒温恒湿(25℃,相对湿度中的丝胶。洗净干燥后的纯丝素纤维在65℃下溶解65%)中平衡24h;湿态强力测试则是将样品于生理于9.3mol/L的溴化锂溶液中,透析3d后过滤得到盐水中浸泡24h后,取出擦干测定。纯丝素溶液。1.5透光率测定取40mL丝素溶液,按乙二醇/丝素质量分数分将共混膜平铺置于24孔板板底,用酶标仪别为0:10、1:10、:10、3:10、:105:06:10比(BIO-EK SYNERGY)分别测定492、550mm及例向丝素溶液中加入相应质量的乙二醇,混合均匀70nm处的吸光度值(A)。千态透光率直接铺板测后倒入聚苯乙烯塑料模具中,在室温下于通风橱中定。测试湿态下的透光率时,先将膜在去离子水中风干即得共混膜。浸泡24h,再将其平铺于培养板底,加入1mL去离1.2结构表征子水进行测试。不同波长下各检测4个孔,取平均使用全自动 X'PERT PRO MPD射线衍射仪(荷值。透光率T计算公式:兰帕纳科公司),CuKa射线,在管电压40kV、管电T/%=10-×100(4)流35mA、扫描速度10°min的条件下,记录得到1.6降解性2=5°~45°的衍射强度曲线。用 Nicolet5700f-i选取质量分数为30%的乙二醇共混膜分别用型傅立叶变换红外光谱仪测试,将共混膜加工成直tris缓冲溶液和蛋白酶-XⅣ溶液降解,对照样为用径小于80μm的粉末后,KBr压片制样,测试4000~体积分数75%乙醇浸泡2h的纯丝素膜。将两种材400cm吸光度得到共混膜的红外吸收光谱。料于去离子水中浸泡72h后取出,干燥后称取降解2 Journal of Silk绸男50年0第09期样品0.1g置入离心管中,按浴比1:100分别向其中悬液,两种材料各重复6孔,置于CO2培养箱中培加入10mL的tris缓冲溶液,2/mL的蛋白酶XⅣ养,隔天换液。分别于1、3、5、7、9d,每孔加入溶液,放置于37℃的水浴恒温震荡器中降解,每两天20μL摩尔浓度为50mol/L的树脂天青溶液,并于换液一次。分别于第1、3、6、9、12、15d取出样品,每培养箱中孵育6h;在酶标仪上测定其荧光强度个时间点重复3次,用去离子水充分洗涤后干燥并(flU值,激发波长530nm,发射波长590mm)(12称重,计算出失重率,将第3d的样品制成粉末用于测定细胞增殖率。X射线衍射。1.7细胞相容性2结果与分析将含乙二醇质量分数为30%的丝素溶液直接2.1丝素蛋白膜的结构加入24孔板风干成膜,对照样为经体积分数75%乙二醇/丝素共混膜的X衍射曲线和红外光谱乙醇处理过的纯丝素膜。取处于对数生长期的图分别如图1(a)和图1(b)所示。由图1(a)中可以L929细胞,胰酶消化后用完全培养基制成细胞悬看出纯丝素膜主要以无定形结构为主,曲线b~g均液,调整细胞浓度为1×103个/mL,每孔加入mL在12.2°、19.7°、24.7°、28.2°、32.3°、36.8°处有衍细胞悬液,两种材料各重复4孔,置于CO2培养箱射峰出现,这说明乙二醇主要是诱导丝素蛋白由无中培养。分别于接种后1、3、5h计数未黏附的细胞规结构向 Silk结晶结构转变;另外当乙二醇/丝素数,计算细胞的黏附率。取处于对数生长期的L929质量比为5/10、6/10(图中的f,g)时,20在9.1°出细胞,胰酶消化后用完全培养基制成细胞悬液,调现了silkⅡ的衍射峰,说明随着乙二醇浓度的升高,整细胞浓度为2×104个/mL,每孔加入200μL细胞逐渐形成SilkⅡ型结晶结构。1653.81629.312421541.9买线01020304030405018001600140012001000800600衍射角)(a)X衍射曲线波数cm(b)红外光谱图曲线ag中,m乙醇丝素0:10,1:102:103:10:10,5:10,6:10图1丝素蛋白共混膜的结构 Fig. 1 Structure of blend silk fibroin membranes由图1(b)可以看出,纯丝素膜的红外吸收峰在膜的吸收峰位置相近,由于在红外谱图上难以区分1651.5cm-1(酰胺I),1542cm-(酰胺Ⅱ,a螺旋与无规卷曲,结合前面的X射线衍射结果,可1244cm(酰胺Ⅱ),属于无规卷曲结构3。乙二以得出这3种比例的乙二醇/丝素共混膜中的丝素醇/丝素质量比为1/10、2/10、3/10(图中的b,c,d)时,蛋白均为α螺旋构象。当乙二醇/丝素质量比为共混膜中的丝素蛋白在酰胺I酰胺Ⅱ、酰胺Ⅲ区的吸4/10、5/10(图中的,f)时,共混膜在酰胺I酰胺Ⅱ收峰均在1653.8、1541.9、1242cm附近,与纯丝素区的吸收峰变宽;继续增加乙二醇的浓度,共混膜逐3第50卷 Vol.013年0月绸 Journal of Silkno.09sep2013渐在1629cm-处出现新的吸收峰,1653.8cm处醇/丝素质量比为6/10时,质量损失率约为20%,故的吸收峰也逐渐变弱,这说明,当乙二醇/丝素质量可知共混膜中的乙二醇还有部分未溶出。比超过4/10时,共混膜中的a螺旋构象逐渐减少,B100100折叠构象逐渐增多。8070由此可知,当乙二醇浓度较低时,其主要促进丝606050素蛋白由无规结构向 Silk结晶结构转变,而当乙二40水系槛40醇/丝素为6/10时,有部分丝素蛋白向SilkⅡ结晶结3020构转变。003.2溶失率102030405060102030405060乙二醇质量分数%乙二醇质量分数%乙二醇/丝素共混膜的热水溶失率如图2所示。(a)丝素蛋白溶失率(b)丝素膜质量损失率在图2(a)中可以看出,乙二醇质量分数为10%时,图2丝素蛋白膜的溶失率共混膜的丝素蛋白溶失率就从纯丝素膜的90%降至 Fig. Dissolve-loss rate of silk fibroin membranes5%以下,继续增加乙二醇的含量,丝素蛋白的溶失3.3力学性能率几乎不变。因此可知,当加入的乙二醇的质量占乙二醇/丝素共混膜在干态和湿态下的力学性丝素蛋白质量的10%时,丝素膜就开始不溶,可以能如图3所示。在干态下,共混膜的强度随着乙二通过将乙二醇与丝素蛋白共混解决丝素蛋白的水溶醇含量的增加而下降,应变则随着乙二醇含量的增性问题。加先增大后减小,这说明乙二醇对丝素蛋白起到增在图2(b)中,乙二醇质量分数为10%时,共混塑作用。同时可以看出,当乙二醇质量分数为30%膜中的乙二醇几乎全部溶出,随着乙二醇浓度的升时,共混膜柔韧性最好,所以可以通过调控乙二醇的高,共混膜的质量损失率呈缓慢上升趋势,当乙二质量分数来制备出所需的力学性能的丝素蛋白膜。60断裂强度114012断裂强度200-断裂伸长率12-断裂伸长率1801600014004000证120606100海蓝业02.00008642iozo3o4o《so《6《020304050《0乙二醇质量分数%乙二醇质量分数%(a)干态力学性能(b)湿态力学性能图3丝素蛋白膜的力学性能 Fig. 3 Mechanical property of silk fibroin membranes从图3(b)中可以看出,在湿态下,共混膜的强度混膜在450500、700m波长下的透光率如图4所示。随着乙二醇质量分数的增大而下降,伸长率变化的由图4(a)可以看出,在干态下,共混膜的透光率极好,规律也是如此。均在90%以上,且乙二醇含量的增加对干态透光率影3.4透光性响不大。由图4(b)可以看出,与千态相比,共混膜湿人眼角膜的透光率随着波长的增加而上升,在态透光率略有下降但仍有着较高的透光率,且其透光450nm处约为80%,在500mm处接近90%,700m率均在90%以上由此可见,乙二醇丝素蛋白共混膜以上时透光率趋于稳定约为95%141干、湿态下的共透光率接近人的角膜,可望用于人的眼角膜修复材料。 Vol.50No.09.sep.2013 Journal of Silk第50卷2013年09月第09期95c95b90a8585102030405060102030405060质量分数/质量分数%(a)态透光率(b)湿态透光a.492nm;b.550nm;c.700nm图4透明丝素蛋白膜的透光性 Fig.4 Light transmission of transparent silk fibroin membranes3.6体外降解100乙二醇/丝素共混膜在蛋白酶XV溶液中的降解情况如图5所示。纯丝素膜和乙二醇/丝素共混80膜在tris缓冲溶液中几乎不降解。从图5(c)可以看口纯丝素膜6030%乙二醇丝素出,纯丝素膜在蛋白酶溶液中,质量分数呈线性下降,在第15d的时候,质量分数下降至50%左右共40混丝素膜则在降解第1d的时候,质量分数就下降至35%左右,在第3d时,下降至13%左右,最后在第206d时几乎全部降解,质量分数还剩6%左右,之后质量分数变化不明显。可见蛋白酶XV对 Silk结构的丝素膜降解作用较强。培养时间/h100:图6L929细胞在透明丝素膜上的黏附率0 Fig.6 Cell attachment of L929 cells on transparent silk fibroin70 membranes50用倒置相差显微镜观察细胞的生长形态,如图740所示。从图7可以看出,第1d时,细胞数目较少,不3020同材料间没有明显差异;第3d时,细胞数目明显增10d多,说明两种材料增殖均较好,纯丝素膜和共混膜上00123456789101112131415降解时间d的细胞形态较好,细胞呈梭形、三角形以及多边形,a.纯丝素膜在tris缓冲溶液的降解;b.30%的乙二醇/丝素共混膜分散也较均匀;培养第5d时,两种材料上的细胞均在tis缓冲溶液中的降解;c.纯丝素膜在蛋白膜溶液中的降解;铺满整个视野,并开始有圆缩细胞产生,细胞数目没d.30%乙二醇/丝素共混膜在蛋白膜溶液中的降解有明显差异。总体看来,共混膜上的细胞不仅形态图5丝素膜在降解过程中的质量分数变化 Fig. 5 Weight changes of silk fibroin membranes during丝素 enzymatic degradation3.7细胞相容性L929细胞在两种丝素膜上的黏附率如图6所示。从图6可以得知,细胞在共混丝素膜上的黏附乙二醇丝素率较好,在1h后就达到了80%以上,并随着时间的 ld 3d 5d增加继续增加。通过SPSS软件分析,乙二醇共混膜图7L929细胞在不同材料上培养不同天数的生长形态与纯丝素膜的细胞黏附率无显著性差异,但要优于Fig.7 Phase contrast light microscope images of929cel纯丝素膜。 cultured different days on different silk fibroin membranes5第52013年绸 Joumnal of Silkc0e01良好,且能够很好地分散在膜上各处,说明共混膜能 silk proteins Progress in Polymer Science2 2039够很好地支持细胞的生长。1093-1115lU值的大小反应了活细胞的数量,如图8所4]Vhux, WANG,eta. l Water-insoluble silk films示。从图8可以看出,L929细胞在共混膜上的增殖 with silk I structure [J]. Acta Biomaterialia, 2010,6(4)::1380-1387较好,在第5d和第7d时,略好于纯丝素膜。经统计[UNGER, WOLF PETERS, et al Growth of分析可知,两者没有显著性差异。 human cells on a non-woven silk fibroin net: a potential for14000纯丝素膜 use in tissue engineering[j]. Biomaterials,2004,25(6):1200030%乙二醇/丝素1069-1075.10000 [6]MADDEN P W, LAI N X, GEORGE A, et al. Human8000 corneal endothelial cell growth on a silk fibroin membrane6000] Biomaterials,20132(1):407640844000 [7] LA WRENCE B D, MARC RCHANT J K, PINDRUS M A, et al2000 Silk film biomaterials for comea tissue engineering [J]. Biomaterials,2009,30(7):1299-130805 [8] KWEON H, HA H C, UM I C, et al. Physical properties of培养天数d silk fibroin/chitosan blend films J]. Journal of Applied图8L929细胞在不同材料上培养不同天数的FLU值 Polymer Science, 2001, 80(7) 928-934. Fig.8 Fluorescence value of L929 cells cultured different days [9 SHE Z, ZHANG, JIN C, et al. Preparation and in vitro on different silk fibroin membranes degradation of porous three-dimensional silk fibroin/chitosan由上可知,共混膜在黏附率和细胞增殖上与纯 scaffold. Polymer Degradation and Stability,2089丝素膜均没有显著性差异,但又略优于纯丝素膜。(7):1316-1322另外,共混膜在乙二醇质量分数为10%时即不溶于10]罗敏清,张岑岑,毛丽,等水不溶性透明丝素蛋白膜的制备及性能[J].高分子材料科学与工程,2011,27(8):水,且柔软性明显优于纯丝素膜,在生物材料上的应141-145用更加广泛。 LUO Minqing, ZHANG Cencen, MAO Li, et al. Preparation of transparent water-insoluble silk fibroin films [J]. Polymer4结论 Materials Science and Engineering, 2011,27(8) 141-145.11]刘宇清,于伟东,孙东豪聚乙二醇一丝素共混膜物理性1)乙二醇/丝素共混膜的丝素溶失率小于2%,能的研究[]东华大学学报:自然科学版,2003,29(6):具有较高的强度与较好的断裂伸长率,在干湿态下100-103.的透光率都超过90%,满足角膜修复材料的要求。 LIU Yuqing, YU Weidong, SUN Donghao. Study on2)乙二醇/丝素共混膜的主要结晶结构为SilkI physical properties of poly ethylene glyeol -silk fibroin在tris缓冲溶液中几乎不降解,在蛋白酶中降解性 polyblend membranes J]. Journal of Donghua University: Natural Science Edition, 2003, 29(6): 100-103.较好。 [12]ANOOPKUMAR-DUKIE S, CAREY J B, CONERE T, et3)乙二醇/丝素共混膜,能够很好地支持成纤维 al. Resazurin assay of radiation response in cultured cells细胞在其上的黏附与增殖,细胞相容性良好。 [] The British Institute of Radiology, 2005, 78 (934):945-947.参考文献:[3] WEI, HUANG,mal,etal. Structure regulation] VEPARI C, KAPLAN D L. Silk as a biomaterial[ J]. Progress of silk fibroin films for controlled drug release[J]. Journal in Polymer Science, 2007,32(8) 991-1007. of Applied Poly ymer cience,2012,125(s2):ea77-e484 [2]WENK E, MERKLE H P, MEINEL L. Silk fibroin as a [14]VAN DEN BERG T, TAN K. Light transmittance of the vehicle for drug delivery applications]. Joumal of human cormea from 320 to 700 nm for different ages J] Controlled Release, 2011, 150(2): 128-141. Vision Research, 1994,34 11) 1453-1456 [3]HARDY J G, SCHEIBEL TR. Composite materials based on6