蛋白质和肽类分子的聚乙二醇化化学

203年第23卷有机化学小. 23. 2003第12期，1340~ 1347Chinese Joursal of Ongaunic ChemistryNO. 12, 1340- 1347●综述与进展●蛋白质和肽类分子的聚乙二醇化化学姜忠义*许松伟王艳强(天津大学化工学院天津3002)摘要蛋白质和肽类生物大分 子聚乙二醇化后,溶解行为改善,稳定性增强,免疫原性消除 或降低,循环 半衰期延长,药物动力学优化,因而在生物技术和生物医学中具有重要的应用前最.聚乙二醇化也逐渐发展成为一种平台技术 .随着聚乙二醇化蛋白质和肽类进入临床试验阶段.聚乙二醇化化学越米越引起研究者的重视简要评述第一一代和第二代聚乙二醇化化学,主要包括聚乙二醇化学修饰剂的类型与性能比较等.关键词蛋白质,肽类. 聚乙二醇化，化学Chemistry for Pegylation of Protein and Peptide MoleculesJLANG, Zhong-Yi"XU, Song-WeiWANG, Yan-Qiang( School of Chemical Enginering and Tehnology，Tanin Unitesit，Taryin 30072)Abstract The pegylated proteins and peptides have found promising applications in biotechnological and bionedicalfields due to the improved solubility, themal and mechanical stabilty, reduced antigenicity and immunogenicity ，enhanced circulating half-lives， optimized pharmacokinetic and pharmacodynamic properties. Consequently,pegylation gadually becomes a platfrm technology . The importance of chemistry of protein and peptide pegylation hasattracted more and more atentions as more PEC conjugates have reached late phase clinical trials. In this paper, thefirst-generation and second- generation pegylation chermistry is briely reviewed, mainly including the diferent types ofPEG chemical modifers and their performance comparison.Keywords protein, peptide, pegylation, chemistry蛋白质和肽类分子的化学修饰已经成为生物技术与生于第二代PEG化化学的聚乙二醇修饰剂正在得到越来越广物医学领域的研究热点,而聚乙二醇(Palycthylenegyol，泛的应用[31.PEG)则是应用最为广泛的大分子修饰剂之一- 20 世纪70年本文简要综述了第一代和第二代PEC化化学,重点介代,Davis首先对蛋白质的PEC化学修饰(又称聚乙二二醇化，绍 了用于蛋白质和肽类分子化学修饰的各种PEG衍生物及PEG化)进行了开拓性研究川.PEC化学修饰实际上.就是在其性能比较.生物活性分子表面共价连接上亲水性PFG长链.蛋白质或肽类分子PEG化后,其主要的生物学和生理学功能保持不1 PEG 的特性变,而可同时获得一些非常期望的性质(2].随着越来越多的PEG-蛋白质偶联物投人到临床应用阶段,人们逐渐认识到PEG化化学在修饰反应中的重要性.现.PEG最常见的形式是以羟基为末端的线性或枝状聚在已经上市的一些PEG-蛋白质偶联物如Adagen'，醚,其化学通式为:Oncopar , PEG-Intron'等,均是基于第-代PEG化化学制备出来的,其特征是:(1)修饰剂的分子最- -般都很低;(2)双官HO(CH2CH20)2CH2CH2OH能团聚乙二醇杂质容易引起交联和团聚;(3)连接键的水解稳定性差;(4)选择性低和副反应存在.为解决上述弊端,基PEG通常呈电中性,易溶于水和许多有机溶剂如乙醇、中国煤化工曲E-mail: zyjing@ tju. edu. cn; Fax: 022-27404066.Racrived Seperdber 20, 2002; rerised March 21, 2003; accepted April 16, 2003 .MYHCNMHGNo. 12姜忠义等:蛋白质和肽类分子的聚乙_醇化化学1341二甲苯、丙酮和氯仿中;PEG的分子最选择余地大,从几百到- 一个氯化物同时生成了一一个带有残留仲胺的连接 剩下的氯几万.用于生物医学的PEG的分子量通常在几百到2000之原子与亲核残基反应活性则低得多,但仍叮使含亲核残基的间;分子量超过10000 的PEG通常尤毒，且已通过FDA认证蛋白质之间发生 交联反应为了解决这一问题,nada等合可用于药物、食品和化妆品;在水溶液中,PEG为高度水合的成了2,4-双链甲氧基PEG-6-氯乙烯三嗪(mPEG2-三氯嗪).聚合物，每个乙氧基单元可以结合2~3个分子水.由于骨架氯原子的低反应活性决定了它只能特异性地与赖氨酸和半的灵活性以及与水分子的结合,PEG分子水力学半径较大，胱氨酸残基反应,而不会引起其他一些副反应.其表观体积为相近分子量的水溶性蛋白质分子体积的5到另一种能够与多种氨基酸发生非特异性反应而以仲胺10倍左右(4.51 ,形式连接到蛋白质、病毒以及脂质体上的烷基化试剂是PEG为避免在修饰过程中发生交联和团聚,通常采用甲氧基三氟乙基磺酸酯.虽然它对某些氨基的专一性比PEG二氯聚乙二醇(mPEG)作为修饰剂的合成原料,其化学通式为:三嗪好,产物中无连接臂的残留,但是偶合反应的机理存在争议,偶联物并不唯-且具有不确定性. Gais等|9)已经发现CHzO(CHCH20),CH2CH20HPEG三氟乙基磺酸酯偶合到小分子氨基上可以产生-种含有可降解磺胺酯连接的产物，这样就会造成PEG与蛋白质制备工艺不同,来源不同，mPEG的分散性大小有很大的偶联物中含有一些降解产物.差别.mPEG的分散性大,所制备的修饰剂的分散性也大,修大多数第- -代PEC化学是那些通过烷基化得到的偶联饰剂与蛋白质或肽类分子形成的偶联物(以下简称偶联物)物.两种用途最广的第一-代 PEG修饰剂是mPEG的琥珀酰亚的分敬性也相应增大,偶联物的均一性难以保证.胺碳酸酯(SC-PEG)和苯并三唑碳酸酯( BTC PEG)I11.虽然另外,由于聚合过程中少量水的存在, mPEG产品中总这两种術生物可以优先与赖氨酸残基反应形成碳酸酯键,但会有1%- 15%的PEG二醇杂质.二醇含量与mPEG的分子也可与组氨酸和酪氨酸残基反应.SC-PEC比BTC-PEG的稳量大小有关, mPEG分子量越小，则二醇含量越低.二醇在定性要好一些,25 C,pH值为8.0时前者的半衰期为20.4mPEG的活化过程中会形成不期望的交联或团聚.min,后者为13.5 min.其他可以和蛋白质形成脲烷键连接的PEG烷基化试剂2 PEG 化化学包括硝基苯碳酸酯(图1pNPC-PEG),三氯苯碳酸酯(TCP-PEG)以及碳酰咪唑(CD-PEG)[12? .这些试剂是通过mPEG末为把PEG偶联到蛋白质或多肽链上，首先须将PEG末端的羟基与氯甲酸酯或碳酰眯唑反应获得的.这些衍生物的端的羟基转化成高反应活性的官能团.如活泼酯、醛基、酰肼反应活性比前述的SC-PEG以及BIC-PEG低.通常,衍生物等.官能团的选择取决于被修饰分子上能修饰的基团类的反应活性越低，修饰专-性越好.第一代PEG衍生物还有琥珀酰亚胺琥珀酸酯(3](SS-型[6!.蛋白质或肽类分子上的反应性官能团多呈亲核性,其亲.PEG).首先mPEG与琥珀酸酐反应,然后将羧酸活化成为琥核活性通常按下列顺序依次递减:巯基> a-氨基>ε-氨基>珀酰亚胺酯就可以制备出SS-PEG.聚合物骨架中含有与蛋羧基>羟基.巯基通常存在于蛋白质的二硫键和活性位点白质反应后留下的第二个酯键.该键在衍生物和蛋白质偶合上.而羧基若不与蛋白质上的氨基发生分子间或分子内中和以后非常容易水解断裂.这不仅仅使这种衍生物失去了作为反应，也很难活化.因此,蛋白质或多肽分子最容易与修饰剂修饰剂的优势,而且水解之后留在蛋白质上的琥珀酸末端可发生作用的位点是分子表面赖氨酸残基上的氨基,包括a- .以成为半抗原,诱发蛋白质的免疫原性.合成第-代PEG衍生物还可通过PEG和一个能与羟基氨基、e-氨基.反应的基团(包括酸酐、氯化物、氯甲酸酯以及碳酸酯)之间2.1第一代PEG 化学的反应.2.1.1与氨基偶联的 PEG化化学PEG化通常要在温和条件下进行.对于蛋白质或肽类分由于具有较高分子量的PEG中二醇杂质所占的比率往子,常常参与反应的基团为a-和ε-氨基.图1中列出了用于往高达15% ,所以第一代PEG衍生物对于蛋白质修饰并不蛋白质或肽类分子中的a-或ε氨基PEG化的第- -代PEC衍是非常理想.生物[6],包括:(a) PEG二氯三嗪衍生物,(b) PEG三氟乙基2.2 第二代PEG化化学磺酸酯,(e) PEG琥珀酰亚胺碳酸酯,(d) PEG苯并三唑碳酸2.2.1与氨基偶联的 PEG化化学依据第二代PEG化化学设计出的PEG衍生物可以较为酯,(e) PEG对硝基苯碳酸酯,(f) PEG三氯苯碳酸酯,(g)有效地解决第-一代PEG衍生物作为化学修饰剂存在的-些PEG碳酰咪唑以及(h) PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯.Davis等工在初期是用氰尿酰氯(三氯均氰,三聚氰酸问题，如二醇杂质存在、仅局限于低分子量mPEG、连接键不氣)法活化的PEG来制备蛋白质的修饰剂.PEG的这种二氯稳定、副反应多、选择性差等.第二代PEG衍生物的第一个; mPEC-乙醛更易制备和.三嗪衍生物可以和多种亲核基团反应,经过修饰后它取代了中国煤化工MHCNMHG1342有机化学Vol.23. 2003OPEG-0-C- 0-CH2CH2-0-C -NI-RPEG-NH-RPEG-0-C-0-NNH-RPEG-0-PEG-OHPEG-0- <~O-PEG^NH-R .PEGPEG-0-C-0-al PFG-0-C-NH-Rcl图1第一代修饰氨基的 PEG術生物Flgure 1 Firsl-generation PEG derivatives for arnine conjugation使用. Kinstler等[15,.6]在进行G-CSF 等的PEG化时发现了mPEG -0CH2CH.CH(OCH2CH)2PEG-丙醒的一个重要特性,就是在酸性条件下(pH=5),醛与a~氨基的偶合具有高选择性,这是由于a-氨基与其他亲核类基团相比具有较低的pK。值.亲电类PEG衍生物与氨mPEG- . OCH2CI2CH(OH)2mPEG-OCH2CH-CII基酸残基的偶合在很大程度上取决于氨基酸残基的亲核性.亲核反应只有在蛋白质水溶液的pH值接近或略高于蛋白质的pK。值时才会发生,所以每个残基的反应活性还取决于相邻的氨基酸残基.虽然选择性仍达不到100%,但是修饰OH2°剂与赖氨酸反应的不均- -性大犬降低.通过SchifT碱的形成mPEG- -OCH2CH2CHOH二mPEG-OCH2CH2CHOH + H2O醛可以偶联到伯胺上,从而得到稳定的仲胺(图2).与其它亲电活性基团不同,醛基只与伯胶反应.只是Shiff碱的形成圄3用于还原性胺化的 PEG醛类水合物的原位生成较为缓慢,容易引起生物分子的失活.需要说明的是,pH值Fgure3 Insiu genenation of PEC- lekyde hydratre wed for rduetve对选择性有显薯的影响,在碱性介质中丙醛基比乙醛基更为amination稳定.mPEG-O(CH2)- -C- -0- -NN-RmPEG- 0CH2CHCH + NH-R缩合、mPEG -OCH2CH2CH还原。mPEC-0CH)CH:CHNH- R團2用PEG丙醛进行还原性胺化mPEG-0(CH2),CH-C- -0- -NFigure 2 Reductive amination by PEG-propiondehyde另一种利用PEG-醛術生物的方式是PEG-丙醒或PEG-乙醛通过酸水解形成的乙缩醛水合物17.8)(图3) .其优点在于图4由PEG丙酸和T酸制备的线形PEGNHS酯(1)和由PEG偶联物的储存稳定性好、纯度高.化学修饰中使用最多的烷丙酸和丁酸制备的叉形PEG NHS酯(2)基化试剂是PEG羧酸酯.它可与氨基在接近体内环境的条Figure4 Linear PEG NHS esters (1) derived from propionic and件下反应,形成稳定的酰胺键,如图4所示，将PEG-羧酸中butanoic acids, and a-branched PEG NHS esters (2) derived from间产物和N_羟基琥珀酰亚胺以及碳二亚胺反应，可以得到propionic and butanoic acidsPEC-琥珀酸活性酯.中国煤化工MHCNMHGNo.12姜忠义等:蛋白质和肽类分子的聚乙二醇化化学1343分子骨架中不含有易降解键的第-种 PEC羧酸衍生物缓慢反应形成稳定的硫醚键.在反应时PEG-IA要过量,同时为羧甲基PEG(CM-PEG)[19],但它过于活泼(在25 C下,pH反应要避光进行,以避免产生游离的碘而与氨基酸反应.将值为8时的水解半衰期为0.75min),难以使用.Harris等制PEG化的半胱氨酸用羟酸水解后,产生的羧甲基半胱氨酸是备了PEG的酯类衍生物,在活泼酯(C0OSu)和PEG最后- -个一种稳定的衍生物,可通过标准氨基酸分析鉴定和定量.正CH2CHO单元之间有一条连接臂,连接臂的长短对反应活性吡啶基二硫化物- -PEC可以在酸性和碱性条件下与蛋白质和选择性有很大影响.例如,带有两个亚甲基的SBA-PEG,在的巯基反应形成稳定的二硫键.25心, pH值为8时水解半衰期为23 min.带有一个亚甲基2.2.3 糖类残基或N-末端的PEG化化学的SPA-PEG,同样条件下的水解半衰期为16.5 min. 由于糖类残基或苏氨酸及丝氨酸上:的N-末端的氧化是蛋白mPEG-SPA和mPEG-SBA的分子骨架中无酯键,所以形成的质进行定点PEC化的另-种方法.糖类可用酶如葡萄糖氧连接键较稳定,并具有理想的反应活性,另外,PEG活性酯对化酶来氧化,或用高碘酸钠进行化学氧化产生具有反应活性于氨基和水的反应活性可以通过在羧酸中引人一个a-分支的醛基,这些醛基可与PEG-肼反应生成腙或与PEC-胺反应形分子来降低.生成可逆的Schif碱124.用硼氢甲腈钠可将腙还原为更稳定2.2.2半 胱氨酸残基的PEG化化学的烷基肼化物,而Schif碱可以还原为仲胺.用PEG-氨基进带有游离巯基的蛋白质为数不多.但是,采用基因工程行还原性烷基化存在的主要问题是，蛋白质上的氨基与手段把巯基引入到蛋白质中的特定位点后[20],就可以用对PEG氨基具有相似的反应活性,这样就有可能形成交联聚集巯基呈现一定反应活性的PEGs对该蛋白质进行高选择性修体.此情况下, PEG-肼化物就更适于使用.虽然在酸性条件下饰.由于蛋白质表面半胱氨酸残基数比赖氨酸残基数要少得蛋白质的氨基主要呈质子化,但由于PEG肼化物的碱性比多,因此半胱氨酸是一个很好的靶位 ,可以实现特异性修饰.伯胺弱,所以反应的结果是选择性地形成PEG腙.利用这个此外,利用疏基可进行不同类型的化学修饰.该途径的潜在方法可以形成多个偶合位点,但修饰位点只对糖类有特异缺点是通过基因工程加人的游离半胱氨酸会增加形成不正性确二硫化物和蛋白质二聚的几率.代表性的有PEG酰肼( PEG hyraide) .酰肼基团极低的为了半胱氨酸PEG化而研制的PEG衍生物有PEG马来pK值使得它可以在酸性环境(pH 4. 5~ 5)中仍可以和羧基酰亚胺乙烯砜、碘代乙酰胺以及正吡啶基二硫化物等(图结合,而蛋白质中的氨基在该条件下由于发生质子化而不能5),这些衍生物各有优缺点[1-23] . PEC-乙烯砜在中性和弱碱与羧基反应,从而可实现选择性定位修饰.性时只与巯基缓慢反应形成稳定的硫醚键,pH升高时,也可另一种定位修饰的途径是利用蛋白质中丝氨酸和苏氨与氨基反应,但速度要慢得多.当反应液中有有机溶剂存在酸上的N_末端,这个末端可以用高碘酸氧化转化为乙醛酸时，,与氨基的副反应也会增加.与PEG-VS不同, PEC-马来酰衍生物.Gaetned25]等氧化白介素8上的丝氨酸的N-末端形亚胺在酸性条件下易与巯基反应,但在水溶液中不稳定,可成乙醛酸衍生物,这种衍生物可以偶合到氧化胺和肼的PEG发生开环或加成反应. PEG-碘代乙酰胺通过亲核取代与巯基2.2.4可逆修饰的 PEG化化学大多数PEG化化学的设计是使PEG与蛋白质之间形成S-R稳定的连接键,以利于偶联物的纯化和长期保存.但有时mPEG-r mPtEG- -N(I)PEG会占据或屏蔽蛋白质的活性位点而降低其活性.另外，PEG偶联物分子量对于蛋白质的活性有直接影响.分子量越大,则体外活性越低而体内活性越高[26].在研制PEG-IntonmPFG--CH=CH2.R--SHT mPEG- -S- -CH2CH2S-R (2偶联物时, Enzon公司用蛋白质和PEG之间可降解的化学键改进药物动力学的半衰期,通过释放天然的干扰素a-2b来减少活性丧失. PEC-Intron偶联物是通过将PEC-SC和干扰素mPEG- NHCCH2I-mPEG- NHCCH2S- -R (3)a-2b在酸性条件下偶合得到的.这样偶合可以使大量的PEG聚集到组氨酸His34上(图6).在此情况下,PEG偶合到mPEG-S-S- -mPEG-S-S-R4)组氨酸的咪唑环上NH的位置上,形成氨基甲酸酯.一段时间后,PEG会从蛋白质上释放出来.PEG-Intron和树型PFG-图5 PEG 巯基衍生物干扰素a-2a (Pegsas)偶联物相比前者体外活性较高,后者体(1) PEC马来院业胺,(2) PEG乙烯磺酸,(3) PEG碘代乙酰胺,(4)PEC邻内活性较高(27,2:氮苯基二硫化物另一种通过PEG化使蛋白质活性恢复的途径是通过酶Figure 5 Thiol reactive PEGs降解、水解或还原将游离的蛋白质释放出来.首先尝试的(1) PEG mleinide, (2) PEC vinygl ulore,r (3) PEG idacetanide and (4)PEG化衍生物是PEC-琥珀酰亚胺琥珀酸酯. Robert等[2)合PEG orthopynidyl disulidle中国煤化工这种双酯可控制蛋白质的YHCN M H G种情况下,将羟基酸接到Vol. 23. 2003有机化学1344来的蛋白质.另-种可释放的PECG街生物是由Benley等1.制备的,将mPEG茉基琥珀酰亚胺碳酸酯和mPFC苯甲酰胺PFG-0-C-0- -NPFG-O-C-0-N琥珀酰亚胶碳酸酯(團9)偶联到溶菌酶的氨基上.偶联物可在生理环境下使原来的蛋白质再生,且通过控制苯上取代基的位置来控制释放的速率.1NII-CH:-CpH<7.0yR-NH.mPEG.)HmPEG、HHzC、PEG- -0-员y-CI2-CH水解mPEG ,0HR-NH2C=O團6 PEG苯并三疃或 PEC-琥珀酰亚胺琥珀酸酯偶联到蛋白质围8 PEG马来酸酐与含有氨墓的蛋白质和肽类分子的耦合与的组氨酸残基上释放过程.Figure 6Corijueation o PECbenotriazode σ PEC sucinimidylFigure 8 Cojueption and rlese process of PCnectymaleiecarbonate to histidine on proteinsanbydride fom arnine containing proteins or ptidtes、,omPEG-O+CH)mCHC-OCI(CH)CH2C -0-mPEGox-50R-NI2mPEG- 0+H)mCHC-OCH(CH)CHC -NH-RYmPFG，mPFG-0-+C112)mCHCOI1HOCH(CH)CH2C -NH-Rk解+ R-NIl2團7 PEC 双酯与蛋白质的偶联和释放过程示意(Y代表脂肪族和芳香族部分)围9 PEC苯基琥珀酰亚胺碳酸酯与含有氨基的蛋白质和肽类Figure7 Corjupation and relee proces of PeC-double estes from分子的耦合与释放过程pouteins (Y is an aliphatic or aromatic moie)Fgure9 Cijupaion end relee poces o PEC-hemg NHScarbonates from amine containing protein or pepidesPEG羧基酸(羧甲基.丙酸基或丁酸基)上形成存在一个酯键的PEC酸(图7).再将末端的酸活化连接到蛋白质的ar或ε-Crenwald 等}321也合成了一种可释放的PEG衍生物,它氨基上.PEG从蛋白质上释放下来后,完全失活的蛋白质在通过1,6消除机理将原来的蛋白质释放出来(图10).而且蛋体内环境下可以有60%恢复活性. PBG双酯的缺陷在于其白质的活性可以恢复到接近100%.所释放出来的蛋白质含有一个易于引|起蛋白质免疫原性的最后的例子就是由Zalipkyp等1]设计的PEG衍生物,它末端.为了减少由于PEG化引起的活性损失,并避免从偶联与蛋白质间形成苯甲基氨基甲酸酯的邻位或间位二硫化物物上释放出来的蛋白质可能引起的免疫原性,霜考虑选择从连接键,在一个温和的还原环境下通过非水解机理将可将原偶联物上释放出来的蛋白质不会引人新基团的PEG衍生物来 的氨基部分再生而把原来的蛋白质释放出来(图11).作为修饰剂.第一种符合上述想法的PEG街生物是Gaman2.2.中国煤化工，等测用来将PEC偶联到组织血浆酶原激活剂和尿激酶的CNMH G人,合成异端双功能基PEG马来酐(图8),两种偶联物均可在体内环境下驊放出原MHNo.12姜忠义等蛋白质和肽类分f的聚乙二醇化化学1345PEG衍生物的要求就提了出来,这类衍生物在PEG链的两合成异端双功能基的PEG衍生物的方法已得到较为迅端具有不同的两个末端基团，其通式为X-PFG-Y,其中两个速的发展，首选的端基有NHS酯、马来酰亚胺、乙烯砜、吡啶独立的功能基X和Y可分别与两个具有不同特性的大分子基二硫化物、胺基和羧酸.在此举几例加以说明.相连接. PEG骨架提供了可溶性、生物降解性、柔顺性和连接与PEG-SPA具有相近反应活性的fureseinePEG-NHS,单元X和Y的一定自由度.-端为黄光素部分 ,另一端为NHS活泼酯.与蛋白质和含氨基的分子偶联后,可借助荧光分析方便地检测偶联物.mPEQ 8 HCQ、.0-PFGo COO-N0=H;CN0YR-NH2COOHmPEG吊 HzC:-NH-RFluorescein- PEG-NHSofOI1H,C'把异端双功能基PEGs 一端的NH2用合适的保护基如OHH;C、CH3Fmoc或t-Boc保护起来,用另一端的活泼基团与目的化合物mPEQ进行反应.用无水三氟乙酸和强碱脱掉保护基后.游离出氨+ CO2+ R-NH2基,再与另一目的化合物偶联.OfNHS- Vinglsulfone (NHS-PEG- VS)和NHS-Maleimide (NHS-图10PEG苯基琥珀酰亚胺碳酸酯与含有氨基的蛋白质和肽类PEG-MAL)为两种异端双功能基PEGs,乙烯砜和马来酰亚胺基团在中性pH值附近即可与巯基反应,与氨基反应则需更分子的耦合与释放过程高pH值.乙烯砜反应活性稍弱,但不易水解;马来酰亚胺活FIgure 10Conjugation and release proces o[ PEG-phenyl NHS性稍强,但易水解.因此, NHS-PEG- vs和NHS-PEC-MAL.在修carbonates from amine containing proteins or peptides饰中可先将氨基与NHS活泼酯连接,再与筑基偶联.0Qo- .o-PEC-NmPEG.NHS-PEG-MAL| R-NH28(-0-PEG-5- -CH=CH2~NH-RmPECG、。 员NHS-PE0-VS| R-SHNHS-PEG生物素的一端为NHS活泼酯,用于和生物活CO2+ R-NH2性分子偶联;另一端为生物素,可与带有亲和素的配体连接，在靶向给药研究中经常使用.Bentley 等[34]首先用苯醇引发PEG聚合生成苯基PEG图11PEG苯基琥珀酰亚胺碳酸酯与含有氨基的蛋白质和肽类(Bz-PEG OH),其上的羟基可以转化为第-个具有反应活性基团.苯乙基可以通过水解或氢解除去,而不会影响到第-Flgure 11 Corjugation and release process of PEG-phenyl NHS个活性基团的化学结构,这样就又产生了一个可以加上第二carbonates from amine containing proteins or pepides个活性基团的新的末端羟基.制备异端双功能基PEG一种这样的异端双功能基PEG衍生物可用作连接两个分子最直接且较有前最的方法昆聚合法.用阴离子引发环氧乙烷用水终止聚合反应可以的亲水、生物相容的间隔物.异端双功能基PEG可以用于多中国煤化工化学方法活化rakogn种场合,如免疫分析，生物传感.药物靶向,液相多肽合成等.*YHCNMHG1346有机化学Vol. 23, 2003等([3)已用这种方法制备了一端带羟基或甲氧基,而另一端结构在保护蛋白免于水解、阻止抗体接近、降低免疫原性等带氨基的PEC衍生物.类似地, Nagasaki等l%)制备出了一端方面比同分子量的线性PEG有效得多Haris 等则)通过在一带甲酸基另一端带羟基的PFG衍生物.不过,该法也有局限个聚合物骨架的末端连接上一个具有三功能基的连接物如性,一是只有那些适合作为PEG末端基团且能引发聚合的丝氨酸或β-谷氨酸而合成出叉状PEG.阴离子才可用,二是不能用于为了防止二醇形成而要求反应Amold等.1.合成了一种具有末端金属螯合基团的PEG体系严格无水的场合.衍生物,这种分子含有两个连接在中心氮原子上的游离羧基2.3PEG结构酸或氨基. PEG衍生物可将蛋白质从含有羧酸或氨基的水溶除了。上面线形PEG分子外,分支形PEG分子对与蛋白液中萃取或沉淀下来形成含有金属离子的复杂化合物.质以及多肽的化学修饰也特别适合.第一种分 支形PEG街Matinez等[41合成了类似的化合物,他们将含有羟基的分子生物2,4二甲氧基聚乙烯6-s_=嗪(mPEG2氯=.嗪)是Inada偶联上两个末端羧基,从而产生了一种PEG化的前药.等[37.以三嗪为核心合成的.此外,还研制了单臂双功能基、双臂双功能基以及多臂Yamasaki等[3]第- -次以赖氨酸为核心合成了一种分支多功能基的衍生物,可将两个或多个反应基团以--定距离隔形PEG结构. Veronese等[9)将两个线形的PEG-BIC, PEC-SC .开,在模拟抗体活性区域及研究蛋白质作用时非常有用.链连到赖氨酸的a氨基和ε氨基上,合成了高纯分支形PEG和PEG2(图12).该偶联方法可使用高分子量PEG,同时3结束语可合成出具有单活性末端基团的PEG衍生物.这些PEG衍生物可通过离子交换色谱纯化，还可以进行进- - 步的衍生.近年来,随着越来越多的PEG偶联物应用于临床试验阶段,人们逐渐意识到蛋白质和肽类的PEG化化学的重要性.正因如此,从第一-代PEG化化学到第二代PEC化化学之CH;O- +CH2CH2O)间的过渡非常快,可以预计,随着大量新型PEG衍生物修饰CH-C-x1)剂的不断出现,蛋白质和肽类分子化学修饰的效率将不断提SYN-CH2)4高148.4.CH2O- +CH2CH2O万)(2)References1 Davis, F. F. Ad. Dnug Delinery Rev. 2002, 54, 457.CH:-(CH2CH2OmC82 Jiang, Z.-Y.; Gao, R.; Wang， Y.-Q. Aeta Phamn. Sin.CH;O- 4CH:CH2Otrg- N- +CH2)4'(3)2002. 37(5), 396 (in Chinese).(姜忠义，高蓉，王艳强，药学学报, 2002, 37(5), 396.)3 Kozlowski, A.; Haris, J. M. J. Contoled Releae 2001, 72,圉12PFG的各种结构(1)分支形PEC(PEG2), (2)线形叉状PrC, (3)分支形叉状PEC4 Jiang, Z.Y.; Gao, R.; Xu, s.-W. Chin. Pharm. J. 2002, .Figure 12 Varous PEG configurations37(6), 409 (in Chinese).(1) Branched PEC (PEC2), (2) linear forked PEC aux! (3) brenched forked(姜忠义，高蓉，许松伟，中国药学杂志，2002. 37(6),PEG409.)5 Hamis, J; Zalipky， s. Poly( ehylegrgeol) Chemistry and与线形PEG相比,分支形PEG具有-些独特性质,例Biological Aplicaions, ACS Books, Washingou D. C.. 1997, p.如,相同分子量的分支形和线形PFG偶联到蛋白质上,前者347的作用比后者要大得多分支形PEG另外的优点是蛋白质6 Jiang, Z.-Y.; Xu, S.-W.; Gao, R. Palym. Bull. 2002, (1),的一个位点上可以同时接上两个PEG链,这样就很有效地34 (in Chinese).减少了蛋白质失活的几率.另外分支形PEG还可有效地防(姜忠义，许松伟,高蓉，高分子通报, 2002, (1), 34.)止蛋白质水解,降低其抗原性以及免疫原性.7 Abuchowski, A.; vanEa, T.; Palcuk, N. C.; Davis, F. F.另一种PEG结构型式是叉状PEC.叉状PEG在一条J. Biol. Chem. 1977，252. 3578.PEG链或分支形分子的-端就有两个活性基团,具有以下优8 Inada, Y.; Funukawa, M. ; Ssaki, H. Trends Biotethnol. 1995,点:(1)产品纯度好;(2)具有很大的空间位阻,只需单一位13(3), 86.点修饰,即可有效地在蛋白质或肽类分子表面形成聚合物的9 Gais, H. J.; Ruppert, s. Tetrahedron Llt. 1995, 36. 3837 .构象云;(3)对修饰位点有选择性.反应基团处在两条PEGFRudolph， s. Biocthnol.链的包围之中,这样高度的立体屏障使得mPEG-~NHS活泼中国煤化工的酯基只能靠近蛋白质表面最容易接近的位点;(4)其伞形TYHCN M H G Chen. 1993, 4, 568.No.12姜忠义等:蛋白质和肽类分子的聚乙二醇化化学134712 Veronese, F. M.; Lagjoli, R.; Boccu, E. ; Beassi,s C. A.;30 Garman, A. J.; Kalindjian, s. B. FEBS ltt.1987, 223, 361.Schiavon, 0. Appl. Biochem. Biotechnol. 1985. 11, 141.31 Zhao, X.; Benrdey, M. D. Ninth Intenational Symposiumn on13 Ahuchowski, A.; Kazo， G. M; Verhoest， C. R. CancerReent Aduances in Dnug Delinery System. Salt cily, Utah, 199,Biochem. Biophys. 1984, 7, 175.14 Harris, J. M.; Heraui, R. M. US 5252714，1993 [ Chern.2 lee, S; Crenwald, R. B.; McGuire, J; Yang, K.; Shi, C.Abstr. 1993, 120, 4058u].Bioconjiugate Chem. 2001, 12, 1635 Kinstler, 0. B.; Brems, D. N.; Iauren, s. L. Pharm. Res.33 Zalipeky, S.; Qazen, M; Walker. J. A.; Mullah, N.; Quin,1996, 13, 996.S. K.; Huang. s. K. Bicniugate (hemn. 1999 10, 703.16 Kinstler, 0. B.; Geg， C. V.; Freeman, A.; Boone, T. 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