重组猪α干扰素的聚乙二醇修饰研究

第36卷第6期湖北畜牧兽医Vol 36 No, 62015年6月Hubei Journal of Animal and Veterinary SciencesJune 2015重组猪α干扰素的聚乙二醇修饰研究李增,赵俊,王明丽(安徽医科大学微生物学教研室合肥230032)摘要:采用分子量为20kD单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-SC)修饰重组猪a干扰素,初步研究了修饰反应条件及分离纯化工艺。结果表明,单修饰PEG-IFNa的转化率达到65%,单修饰产品纯度达到97%。由于修饰产物相对分子质量和不均一性的增加,导致其体外杭病毒活性降低,抗病毒活性保留达到未修饰重组猪α干扰意的29%,仍然具有良好的抗病毒作用。关键词:聚乙二醇;重组猪α千扰素;修饰中图分类号:S828文献标识码:A文章编号:1007-273X(2015)06-0005-02PEG(聚乙二醇)是一种中性、水溶性、无毒性的本研究采用分子量大、反应条件温和的20k△聚合物。在水溶液中长链的PEG分子,具有高水合单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯(μⅠIEr-∑X)性,可以附着到其他分子和表面上,提供了一个生物修饰剂对重组猪a干扰素进行了修饰(图1),并通相溶的、保护性外壳。这种保护性外壳降低了生物系过控制反应条件期望获得半衰期更长、更稳定,且统对这些材料的清除能力极大的降低了蛋白质细体外活性保留较高的∏Er化重组猪a干扰素产物。胞和细菌的吸附降低了肾脏的清除率。PEG在水和且对该单修饰产物进行了纯度、体外抗病毒活性进许多有机溶剂中可溶,在水溶液中它和其他聚合物行了检测,为进一步考察其药代动力学和药效学性如葡聚糖一起可形成双相系统。双功能PEG的水溶质奠定了基础。性、无毒性、高柔性和特征明确的化学特性,使它成为理想的修饰蛋白类产品的交联材料。PEG与干m-00N+mn一m-0NOPm扰素的偶联已广泛应用于用于临床。如先灵葆雅公Protein司开发的聚乙二醇化人干扰素α-2B(商品名,佩乐能, PegIntron);罗氏公司开发的聚乙二醇化人干扰图1mPEG-SC与重组猪a干扰素反应式素α-2B(商品名派罗先, Pegasys)等。已经证实被偶联后的干扰素生物学活性大部分得以保留,同时1材料与方法免疫应答极大地降低,血清半衰期也极大地得到了1.1试验材料延长。原料:单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯动物a型干扰素对畜禽病毒性疾病具有较好的(mPEG-SC),重组猪α干扰素。防治效果。安徽医科大学微生物学教研室采用基因仪器: Amersham Pharmacia公司的 AKT A Ex-工程技术克隆并表达了猪a型干扰素,并将实验室 poorer色谱系统;北京六一仪器厂的DYY-Ⅲ4稳合格产品制成冻干粉针剂发送至安徽省多家养猪场压稳流电泳仪。进行临床试验。结果证明,该室研制的重组猪α干扰试剂:牛血清白蛋白;甲叉丙烯酰胺;丙烯酰素能有效治疗猪病毒性疾病。对治疗猪病毒性腹泻胺、SDS;考马斯亮蓝R250;RRMI1640培养基;小有效率为83%,治愈率为639%。在该项目的基础牛血清;其余试剂均为国产分析纯或生化纯试剂。上,对重组猪α干扰素进行聚乙二醇化修饰,以获得12试验方法长效制剂,从而延长药物在体内循环半衰期、减少体1.2.1聚乙二醇-重组猪α干扰素的制备与纯化内清除率减少给药次数、降低动物的应激性、增强干扰素用5mmo/LpH30-5.0的磷酸二氢钾缓冲疗效、降低用药成本。作为新型兽药的开发这一项目液稀释到0.1mg/mL;加入计算量的干扰素,用有重要的学术价值和应用前景,同时具有较高的社NaOH溶液调节pH到8.0,按干扰素:mPEG为1:20会效益和经济效益。的物质的量加入114量的mPEG-SC,在0-4℃条件收稿日期:2015-0406基金项目:安徽省自然科学基金(1308085Qc53)作者简介:李增(1985-),男,安徽颖上人,副教授,主要从事兽医药理学方面的教学与科研工作。湖北畜牧兽医15年下反应,随后每间隔2h加入1/4量的mPEG-SC加理,24h后吸弃,再分别接种100D50的ws病入完毕后继续反应4h,加入075mo的甘氨酸1mL毒。结果表明聚乙二醇修饰后的重组猪a干扰素能终止反应;随后将上述反应液用5倍量体积、浓度为够明显抑制vSⅴ引起的细胞病变,通过效价测定50 mmol/L pH72的醋酸钠缓冲液稀释,然后上Su(表1),所得的单修饰产物活性保留达到了29%perdex75 Highload制备型凝胶色谱柱(26mm×600表1干扰素抗病毒活性液洗柱后,用含05 I/L NaCl的醋酸钠缓冲液洗样品效价/umg活性保留率/%脱,收集含PEG_干扰素的洗脱液,浓缩,SDS-PAGEUnmodified IFN1.0×103电泳检测。用 Superdex200对“()中得到PEC化_Mm2.9×10干扰素进一步纯化,洗脱液为pH7.2的醋酸钠缓冲液(含02 mol/L NaCl),用波长为280m的紫外吸3讨论收检测,收集含PEG-干扰素的洗脱液,浓缩。蛋白质分子中的氧基有较高的亲核反应活性,12.2SDS-PAGE电泳法对产物的检测对浓缩的而含有氨基的氨基酸主要有Lys和氮末端的氨基各洗脱峰采用SDS-PAGE电泳检测,分离胶10%,对大部分蛋白来说,通常赖氨酸含量比较高,因而赖浓缩胶5%。电泳结束后,将胶体固定(固定液:30%氨酸的氨基是最易被PEG修饰的位点5。酰基化甲醇5%乙酸)室温摇动染色1h(染色液:005%考PEG里包括经常使用的mPEG-SC、mPEG-SS。其中,马斯亮蓝、30%甲醇、5%乙酸);最后将胶体移人脱色自从9年代初开始开发 mPEG-SC以来,由于其与液(脱色液:1%戊二醛、30%甲醇、5%乙酸)中室温摇蛋白反应时条件温和,应用的最多。动浸泡直至条带清晰为止。本研究采用分子量为20000的单mPEG_SC对1.2.3蛋白浓度的测定以牛血清蛋白为标准,按重组猪α干扰素进行了修饰。干扰素与干扰素修饰Lowy法3测定浓缩后的蛋白浓度。产物之间的主要差别之一是分子量的差异,因此本1.24抗病毒活性的测定采用WISH-VSV系统实验采用凝胶过滤色谱分离纯化聚乙二醇修饰重组检测干扰素的抗病毒活性。猪α干扰素。这种分离模式是已经用于工业化生产2结果与分析工艺成熟。利用该分离条件,我们成功的纯化获得聚乙二醇修饰重组猪α干扰素。此分离纯化模式相对2.1聚乙二醇重组猪a干扰素的制备与纯化比较稳定,回收率较为理想,一方面满足了后续聚乙猪α干扰素的等电点在62左右,经聚乙二醇二醇修饰重组猪α干扰素性质研究的需要,另一方修饰后,等电点有所降低,因此可采用离子交换层析面为它走向工业生产进行尝试,希望能为聚乙二醇的方法对反应产物进行分离纯化。结果如图2所示,修饰重组猪a干扰素产品的工业生产提供参考。抗经SDS-PAGE电泳检测结果表明,修饰后产物分离病毒活性研究所得的修饰产品中IFN体外抗病毒活组分(聚乙二醇重组猪a千扰素)呈单一条带纯度性随着修饰后相对分子质量的增加而降低,但活性能够达到97%。对条带3反应原液各组分经光密度保留达到了29%,仍然具有良好的抗病毒活性。计算可知反应修饰率能够达到65%。在本研究中,实验的反应条件温和可控,对氮端修饰率高,分离纯化工艺简单,收率高,可获得高纯1 16 KDa度高均一性的样品,确定了定点修饰干扰素的先导66.2 KDa化合物,为后续开发研究工作奠定了基础。参考文献45 KD[1] PASUT G, VERONESE F MState of the art in PEGylation35 KDaThe great versatility achieved after forty years of research [J]J Control Release,2012,161(2):461-472.25 KI[2]赵俊,张俊玲,李增,等.重组猪干扰素a1冻干粉针剂对猪的安全性试验研究[J中国畜牧兽医,2014(1):195-19818.4 KDa[3]目萍杨琦,王惠珍,等.改良Lowy法和 Bradford法测定蚯14. 4 KDa蚓提取物中蛋白质含量的比较[J].山西医科大学学报,20061. Maker;2猪干扰素;3反应原液;4纯化后产物[4]中华人民共和国卫生部中国生物制品规程.一部[M].北京:中图2重组猪α干扰素与聚乙二醇修饰国人口出版社,1995.268-269产物的 SDS-PAGE[5]杨旭,贡济.宇蛋白多肽类药物聚乙二醇化修饰研究进展[J].中国当代医药,2012,31(19):16-2022聚乙二醇一重组猪a干扰素抗病毒活性对WH细胞用不同剂量的修饰干扰素进行处