合成气发酵生产乙醇菌株的筛选

网络优先数字出版时间:2014-4-01网络优先数字出版地址http://www.cnkinet/kems/doi/10.13656/j.cnkigxkx.20140401.002.html广西科学 Guangxi Sciences2014,21(2):124~128合成气发酵生产乙醇菌株的筛选Screening of a Microbial Strain Capable of producingEthanol from Syngas Fermentation郭铃,黄艳燕,潘丽霞,李检秀,孙菲菲,孙靓,黄日波GUO Ling, HUANG Yan-yan, PAN Li-xia, LI Jian-xiu, SuN Fei-fei. SUN LiangHUanG Ri-bo(广西科学院,非粮生物质酧解国家重点实验室,国家非粮生物质能源工程技术研究中心,广西生物质产业化工程院,广西生物炼制重点实验室,广西南宁530007)(Guangxi Academy of Sciences, State Key Laboratory of Non-Food Biomass and Enzyme Technology, National Engineering Research Center for Non-food Biorefinery, Guangxi Biomass Industrialization Engineering Institute, Guangxi Key Laboratory of Biorefinery. Nanning, Guangxi, 530007, China摘要:【目的】从动物粪便样品中分离能利用合成气生产乙醇的菌株,并对其进行鉴定及初步发酵实验,为工业利用合成气生产乙醇奠定理论基础。【方法】利用富集驯化培养技术,以合成气为唯一碳源,分离筛选合成气利用菌,通过形态观察、生理生化实验及16 SrrNA序列分析鉴定菌株,并利用菌株进行初步发酵实验。【结果】分离到1株可以发酵合成气生产乙醇的菌株,分子鉴定结果表明,该菌株为 Clostridium ljungdahlii。生理生化分析结果显示:该菌是严格厌氧型革兰氏阳性菌,短杄状,有运动性,芽孢很少见,生长必须因子包括酵母粉和维生素B族;最适碳源为果糖,最适生长温度35~37℃,最适pH值为6.0~7.0。合成气发酵实验结果显示:3℃,厌氧静止发酵30d乙醇最高产量达到2.58g/L,添加BFSA、莫能菌素、丁基橡胶颗粒可以使乙醇产量分别提高49%、70%、4.3%,最大产量达到4.31g/L。【结论】从动物粪便中分离到1株( clostridium ljungdahlii,该菌能够利用合成气生产乙醇,为进一步研究和开发新型生物质材料提供了基础资料。关键词:合成气厌氧发酵梭状芽孢杆菌乙醇中图分类号:Q939文献标识码:A文章编号:1005-9164(2014)02-0124-05Abstract: (Objective]To isolate and identify a microbial strain capable of producing ethanol fromsyngas fermentation from animal waste. [Methods] The enrichment culture using syngas as thesole carbon source was utilized to isolate the strain, which was identified according to the ob-servation of morphology, physiological and biochemical tests, and analysis of 16S rRNa genesequences. The isolated strain was utilized for preliminary fermentation. [Results] a strain capable of fermenting syngas into ethanol was isolated successfully. The strain was identified asClostridium ljungdahlii, which is a strictanaerobe and gram-positive. The cells are rod收稿日期:2013-11-29shaped and show motility; spores are formed in-修回日期:2014-01-24frequently; the strain requires a minimum level作者简介:郭铃(1983-),男,碩士,主要从事微生物发酵与酶工of yeast extract (0.1%) and B-vitamins for程研究growth; substrate optimum is fructose; temper广西科学院基本科研业务费项目(11y2sw12、 ature optimum range is35~37℃; pH optimum11y2sW1),广西自然科学基金项目(2013 GXNSFBA019089) range Is6.0~7.0; batch fermentation revealsthat under anaerobic conditions the highest yield**通信作者:黄日波(1958-),男,教授,博士生导师,主要从 of ethanol in serum bottles at37℃was2.58g/Lafter 30d by addition of bESA. monensin and分子酶工程研究。Email:ruhuang@gxas.ac.cnbutyl rubber particles yields of ethanol can inrease 49 %.70% and 4.3%.respectively, with the highest yield of ethanol at 4.31g/LICon-clusion] Clostridium Ljungdahlii was capable of producing ethanol from syngas fermentationKey words: syngas, anaerobic fermentation, Clostridium ljungdahlii, ethanol【研究意义】随着化石能源日益枯竭,寻找新的可匀后取ImL培养物接种到含有40mL筛选培养基的再生替代能源就成为全世界最关注的热点。乙醇是血清瓶中,以合成气为唯一碳源,37℃厌氧静止培养种优质的液体燃料,单位质量的乙醇完全燃烧时可3d,取有生长趋势的培养物,稀释1×10·倍后接种释放约30KJ的热量,是目前为止最有效的化石能源到新鲜的筛选培养基中,重复培养30d,重复以上步替代品。目前,燃料乙醇的生产方法主要有化学合成骤3次后,取培养物稀释1×10°倍后涂布于固体与微生物发酵两种方式,化学合成法主要是乙烯直接CLM培养基上,以果糖为唯一碳源,37℃厌氧静止培水合法;微生物发酵法主要有以糖质原料和淀粉质原养3d后,挑取单克隆于液体CLM培养基中,以果糖料为底物直接发酵和以纤维素原料水解发酵两种方为唯一碳源,37℃厌氧静止培养24~36h,用甘油保式。利用微生物发酵合成气生产乙醇是以生物质为存菌种原料生产乙醇的新工艺1,即先将生物质完全气化生1.3菌株的鉴定成以CO、CO2、H2、N2等为主要成分的生物合成气,提取菌株基因组DNA,PCR扩增16 SrrNA(引再利用一些特殊的微生物将合成气转化为乙醇,该新物27: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492r:工艺发酵条件简单,原料来源广泛,且大大降低了废 TACGGCTACCTTGTTACGACTI),送上海生工液废渣的排放2,属于环保型新技术。【前人研究进测序公司测序。展】20世纪80年代以来,国外研究人员相继在鸡粪、1.4菌株生理生化分析兔粪等动物粪便以及农业泄湖、沼气池中发现了一些菌株生理生化分析的具体方法参见文献可利用合成气生产乙醇的菌株,主要研究的微生1.5菌株生长曲线的测定物有以下几种: Clostridium ljungdahlii L分别挑取 Clostridium ljungdahlii单菌落于Clostri -dium autoethanogenum, Moorella thermoRCM培养基和CLM培养基中,37℃厌氧静止培养ilic sp. HUC22-1. Clostridium scatologenes24h,次日按1%的接种量接种于10 ML RCM培养基rain sI1l,( lostridium carboridivorans p7,这和CLM培养基中,以果糖为唯一碳源,37℃厌氧静些菌株都是严格厌氧菌,可以在高浓度合成气条件下止培养至OD6≈0.2时,按2%的接种量接种到生长并产生乙醇。【本研究切入点】目前,国内尚未见50mL的相应培养基中,37℃厌氧静止培养50h,每有关利用合成气发酵生产乙醇菌株的相关报道。【拟2~4h取样检测ODo值解决的关键问题】从广西象州家禽养殖场、沼气池等1.6菌株初步发酵实验地采集到的鸡、牛等动物粪便中筛选到1株能够利用挑取 Clostridium ljungdahlii单菌落于CLM合成气生产乙醇的菌株,对其进行生理生化分析及初培养基中,以果糖为唯一碳源,37℃厌氧静止培养步发酵实验,摸索菌株的生长发酵条件,为工业化发24h,按1%的接种量接种于10 ML CLM培养基中酵合成气生产乙醇提供理论依据。以果糖为唯一碳源,37℃厌氧静止培养至OD6。≈1材料与方法0.6时,按5%的接种量接种到发酵培养基中,抽出空气,充入合成气,密封血清瓶后,37℃厌氧静止培养1.1材料30d,每3~7d补气1次。样品: Clostridium ljungdahlii由本研究筛选1.7乙醇测定获得用注射器抽取2.5mL发酵液,12000r/min离心培养基:本研究所用培养基参考文献[5~12],略10min,取上清,以0.1%的乙腈为内标,气相检测乙有修改醇产量,根据乙醇和乙腈峰面积比计算乙醇含量。合成气:购自南宁国信气体有限公司,含73%乙醇含量(g/L)=(乙醇峰面积/乙腈峰面积)CO,10%CO2,15%H2,2%CH4,或者80%H2,20%1.020,式中1.020为换算常数,根据同一条件下测定乙醇和乙腈的标准曲线回归方程求得1.2菌株的富集与筛选测定乙醇含量采用 Agilent technologies6890N在厌氧条件下称取1.0g新鲜的动物粪便,溶于 GC systen气相色谱,检测器采用FID,柱型号:Agi0.3m,载气为氮气,载气流率20mL/min,氢气流率、婚40mL/min,分流比1:50,色谱进样口和柱子的温度分别为250℃和100℃Eo2结果与分析2.1菌株鉴定结果提取菌株基因组DNA后,PCR扩增16SrRNA,测序结果经 Genebank比对,比对结果(表1)显示与 Clostridium ljungdahlii同源性为99%,可图2革兰氏染色后镜检结果以初步判定该菌株为 Clostridium ljungdahlii。Fig 2 Electron microscopy of the strain after gram staining表1菌株16 S rrNa片段序列比对结果表2不同酵母粉含量对菌株生长的影响Table 2 Effect of different yeast powder on strain growthTable 1 Comparison of 16s rRNA sequence of strain by sequencing and Blast analysis碳源酵母粉 Yeast extracto%)Carbon source编号基因文库编号最相似菌株相似度00.020.040.060.080.10.20.5No. Genbank Accession Most similar straiidentity(%)Fructose不添加果糖1NR074161.1538growth: w: Weak growth.(2)维生素B族及氨基酸3Y18178,1从表3可以看出, Clostridium ljungdahlii菌株061在添加维生素B族的条件下生长良好,在添加氨基2.2菌株生理生化分析酸的条件下生长很微弱,因此可以初步判定维生素族是 Clostridium ljungdahlii生长必须因子,氨基2.2.1菌落特征菌落为白色或灰白色,边缘呈不规则状,中间凸酸对 Clostridium ljungdahlii的生长不起到决定性的作用。起有光泽。显微镜下呈棒状或短杆状,有运动性,芽表3维生素B族及氨基醱对菌株生长的影响孢很少见,严格厌氧菌,革兰氏染色后显紫色(图1和Tab3 Effect of B-Vitamins and amino acid on strain growth图2),表明为革兰氏阳性菌,与文献[5]的报道一致添加情况维生素B族氨基酸Adding conditionB-vitamin solution Amino acid solution添加 Adding不添加 Without adding不生长;w:微弱生长。+: Positive growth;growth: w: Weak growth(3)可用碳源从表4可以看出,( lostridium ljungdahlii在CLM培养中可以利用合成气、木糖、果糖、阿拉伯糖丙酮酸盐及乙醇作为碳源,生长良好,果糖生长最快,图1显微镜下菌体情况而葡萄糖为唯一碳源时生长非常缓慢。Fig 1 Electron microscopy of the strain2.2.3菌株最适生长条件2.2.2菌株生长必须因子图3和图4表明,菌株的最适生长温度为35~(1)酵母粉37℃,最适pH值为6.0~7.0。从表2可以看出, Clostridium ljungdahlii菌株2.2.4菌株耐氧实验的生长需要酵母粉,当酵母粉含量低于0.06%时,在菌株耐氧实验发现.当空气含量为0.1%或含有碳源的条件下,菌株也不生长;但当酵母粉含量0.2%时,菌株可以生长;当空气含量为0.5%时,菌大于等于0.2%后,即使不另外添加碳源也能微弱生株微弱生长;当空气含量为0.75%或1.0%时,菌株常生长;当空气含量超过0.75%时,菌株生长受到抑长状况有较大差异,在RCM培养基中生长迅速,且制,不能正常生长菌体密度大,在CLM培养基中生长相对缓慢,且菌表4 Clostridium ljungdahlii在单一碳源下的生长状况体密度低,其原因是由于RCM培养基是完全培养Table↓ Growth of Clostridium Ijungdahlii on substratesεs基,营养丰富更适合菌株的生长复苏the sole carbon生长状况‖碳源生长状况Growth‖ CarbonGrowthsituation‖ sourcecuatro合成气 SyngasCO2/H2木糖 Xylose+果糖 Fructose阿拉伯糖 Arabinose葡萄糖 Glucose蔗糖 Sucrose甘油 Glycerol00=°°L-乳酸盐L- lactate丙酮酸盐 Pyruvate.柠檬酸盐 Citrate麦芽糖 Maltose时间Iieh)甲醇 Methanol乙醇 Ethanol图5 Clostridium ljungdahlii生长曲线淀粉 Starch山梨醇 SorbiteFig 5 Growth curve of Clostridium ljungdahli乳糖 Lactose●:RCM,a:CLM,:生长:-:不生长;w:微弱生长。+: Positive growth;-:No2.4合成气发酵乙醇的初步实验growth: w: Weak growth气相色谱检测结果(图6)显示,发酵液中有乙醇生成,乙醇产量在0.68~2.58g/L之间,其中20mL血清瓶中几乎没有乙醇生成,250mL血清瓶中普遍较高,推测血清瓶体积越大,所能容纳的合成气越多,0.45乙醇产量越高H值 ph valud最适pH值Fig 3 Optimum pH of Clostridium ljungdahlvo5清瓶体积 volume of serum bottle ml.)醇产量分析Fig 6 Yield analysis of ethanol2.5乙醇产量优化实验从表5可以看出,添加BESA、莫能菌素及丁基湿度 Tcimpcraturc()橡胶颗粒后,乙醇平均产量均有所提高,分别提高了图4( Lostridium ljungdahlii最适生长温度49%、70%、4.3%,其中莫能菌素提高最多,BESA次Fig.4 Optimum temperature of( Lostridium ljungdahlii之,丁基橡胶颗粒最低,这是由于莫能菌素和BESA2.3 Clostridium ljungdahlii生长曲线都可以抑制甲烷的生成,促进乙醇和乙酸的生成,而按照1.7方法测定( clostridium ljungdahlii在丁基橡胶颗粒的主要作用是吸附气体,提高气体在培不同培养基中的生长曲线,结果(图5)表明,在RCM养基中的溶解度,从而提高乙醇的产量,但是由于发培养基中,菌株几乎没有延滞期,2h后菌株OD。达酵过程是静止的,丁基橡胶颗粒大多沉到底部,导致到0.2,然后迅速进入对数期,28h后生长速度开始减吸附气体量减少,对乙醇产量提高所起的作用不大缓进入稳定期,OD6最大值达到1.93左右;而Clostridium ljungdahlii在CLM培养基中,前23讨论8h菌株几乎不生长,20h左右,OD达到0.2,24本研究成功地从动物粪便中筛选到1株可以发3$h内为菌株生长的对数期,4h后菌株生长趋于稳酵合成气生产乙醇的菌株,经菌株生理生化分析以及定,OD0最大值达到0.89。从结果中可以看出,16 S rrNA鉴定为 Clostridium ljungdahlii,我们利表5添加BESA、莫能菌素和丁基橡胶颗粒对乙醇产量的影forward for biofuels and biomaterials[]. Science, 2006响(g/311(27):484-489Table 5 Effect of adding BESA, monensin and butyl rubl[3 Vega J L, Prieto S, Elmore BB, et al. The biological pro-articles on yield of ethanol(g/L)duction of ethanol from synthesis gas[JJ. Appl BiochemBiotech,1989,20-21(1):781-797添加情况BESA能菌素橡胶颗粒[4] Hurst K M. Lewis R S Carbon monoxide partial pres-particlesure effects on the metabolic process of syngas fermen添加 Addingtation[J]. Biochem Eng J, 2010, 48(2): 159-165不添加 Without adding2.54[] Gaddy J L, Clausen E C. Clostridium ljungdahlii,annaerobic ethanol and acetate producing microorganism的初步实验,实验结果显示该菌株能够在以合成气为US,5173429[P].1992-12-22唯一碳源的培养基中生长并产生乙醇,经30d血清瓶61skns, Nakashimada Y. Yoshimoto. Ethanol production from H, and CO by a newly isolated thermophilic发酵,乙醇产量达到2.58g/L,添加BESA、莫能菌bacterium,Moorella sp. HUC22-1 [J]. Biotechnology素、丁基橡胶颗粒可以分别使乙醇产量提高49%Letters,2004,26:1607-16170%、4.3%,最高产量达到4.31g/I[7 Kusel K, Dorsch T, Acker G, et al. Clostridium scato在实验过程中,研究发现不同组分含量的合成气logenes strain SIl isolated as anacetogenic bacteriumfrom acidic sediments [J]. Int J Syst Evol Microbiol会导致乙醇产量的不同1,同时合成气中除了CO、2000,50:537-546CO2、H2等主要成分外,还含有硫化氢、焦油、NO等[8] Gaddy J I,ArkF. Biological production of ethanol from不可利用的有毒有害气体,也会在发酵过程中影响菌waste gases with Clostridium ljungdahlii: US,6136577株的生长和代谢。另外,发酵产物检测结果显示,菌[P.200010-24.株发酵合成气最主要的产物是乙酸和乙醇,当pH值91aour, Younesi H. Ethanol and acetate synthesisfrom waste gas using batch culture of Clostridium为4~5时,发酵主产物是乙醇,当pH值为6~7时ljungdahlii [J]. Enzyme and Microbial Technology发酵主产物是乙酸,然而 Clostridium ljungdahlii2006,38:223-2最适pH值是6~7,pH值过低会影响菌株的生长,[0 Younes, Najafpour G. Mohamed r. Ethanol and实验结果也表明在pH值为4~5范围内,单位菌体acetate production from synthesis gas via fermentationprocesses using anaerobic bacterium, Clostridi密度的乙醇产量更高,但是由于菌株生长受到抑制,ljungdahlii [J]. Biochemical Engineering Journal导致乙醇总产量较低。因此,提高菌株的耐酸性也是2005,27:110-119.后续研究过程中亟待解决的问题。此外,合成气的通11 Cotter L. Chinn m s. Grundena m. Ethanol and ac入方式也是制约乙醇产量的一个关键因素,本研究主etate production by Clostridium ljungdahlii andClostridium autoethanogen um using resting cells[J1要采用间隙补气,无法保证稳定的气压和气液接触,Bioprocess Biosyst Eng, 2009, 32: 369-380影响了菌株的转化效率,致使乙醇产量保持在一个较12] Mclnerney M J, Bryant M P, Pfennig N. Anaerobic bac低的水平。 Vel berzin等1采用高压连续通气法,乙terium that degrades fatty acids in syntrophic associa醇产量最高达到27.2g/I,这也为我们的后续发酵实tion with Methanogens[J]. Arch Microbiol, 1979.122验提供了新的思路13]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科本研究结果表明,利用 Clostridium ljungdahlii学出版社,2001发酵合成气生产乙醇的工艺是可行的,但由于受到菌Dong X Z, Cai M Y Scientific identification manual of株生长条件、合成气组分以及发酵设备等条件的限comom acteria[M. Beijing Science Press, 2001[14 Liu K. Atiyeh H K. Tanner R S, et al. Fermentative制,目前乙醇产量还很低。在接下来的工作中,将主production of ethanol from syngas using novel moder-要着力于改进发酵设备以及利用分子手段改造菌株ely alkaliphilic strains of Alkalibaculum bacchi [J]两方面,以期获得一种高效、快速、环保的乙醇生物发Bioresour Technol, 2012. 104: 336-341酵新工艺。[15 Berzin V. Kiriukhin M, Tyurin M. Eliminationate production to improve ethanol yield duringcontin参考文献lous synthesis gas fermentation by engineered biocatayst Clostridium sp. MTEtOH550 [J]. Appl Biochem[1 Klasson K T, Ackerson M D Bioconversion of synthesisBiotechnol.2012,167(2):338-347gaseous fuels[J]. Engy Technology, 1992, 14: 602-608(责任编辑:陈小玲)[2 Ragauskas A J. Williams C K. Davison B H. The path