单端马来酰亚胺基功能化聚乙二醇的制备

第41卷第3期应用化工Vol.41 No. 32012 年3月Applied Chemical IndustryMar. 2012单端马来酰亚胺基功能化聚乙二醇的制备王婷',孟庆斌”,王晨宏",倪才华'(1.江南大学化学与材料工程学院,江苏无锡214122 ;2.军事医学科学院毒物药物研究所.北京100850)摘要:以PEC2000为初始原料,通过与小分子的反应, 将其一端羟基保留,得到NH2-PEC2000-0H,然后将NH2-PE2000-0H与6-(马来酰亚胺基)已酸琥珀酰亚胺酯反应,得到单端马来酰亚胺基修饰的聚乙二醇( Mal-( CH2)s-CONH-PEG2000-0H)。经过' H NMR验证,结果表明,通过这条合成路线能够成功得到单端马来酰亚胺基功能化的聚乙二醇。关键词:聚乙二醇( PEC) ;单端功能化;马来酰亚胺中图分类号: TQ 31;0 631文献标识码:A文章编号:1671 -3206(2012)03 -0438 -04Preparation of monofunctional maleimido-poly( ethylene glycol)WANG Ting' ,MENG Qing bin2 , WANG Chen -hong2 ,NI Cai hua'(1. School of Chemical and Material Engineering ,Jiangnan University , Wuxi 214122 , China;2. Institute of Pharmacology and Toxicology ,Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850 ,China)Abstract : With PEG2000 as initial material , NH2- PEG2000-0H was first synthesized from 0H-PEG2000-OH, and then Mal-( CH, )5-CONH-PEG2000-0H was made from NH2 -PEG2000-0H and 6- maleim-idohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester. The structure of the fnal product and intermediates werecharacterized and confirmed by " H NMR. The results revealed that the heterobifunctional PEG with a ma-leimide group on one end and a hydroxyl group at the other can be obtained by this method.Key words : poly( ethylene glycol) ( PEC) ; heterobifunctional; maleimide聚乙二醇(PEG),是一种既能溶于水也可以溶基在多肽蛋白组成中数量不多,但是位置确定,可对于多种有机溶剂,无毒以及具有良好的生物相容性巯基进行定点修饰14]。目前,应用较多的是将聚乙的高分子材料。PEC以其优良的理化特性,广泛地二醇端基活化为马来酰亚胺基,与巯基在温和的条应用于药学和生物医学领域1-3]。PEG修饰后的药件下就能反应,这也是目前多肽或蛋白PEG修饰的物与原型药物相比,具有提高药物溶解性,延长半衰主要方式1516]。作为连接臂的PEG另-端还需要期，血液浓度波动较小,减少免疫原性和抗原性,降不同的基团来进行其他的反应,这种一端为马来酰低毒性等优势4s]。紫杉醇等难溶性药物经PEG修亚胺基另一端为其他基团的PEG在生物大分子修饰后,溶解性和药效均可得到提升|0)。在体内半衰饰连接上具有重要的作用。期短的多肽蛋白类药物可通过PEG修饰的方式延本文介绍了一种将聚乙二醇- -端羟基活化为马来酰亚胺基,另一端羟基保留的化学合成路线。首长半衰期。聚乙二醇作为修饰剂时,功能化的端基成为与先将PEG的一端氨基化,再与所合成的小分子6-其他分子反应的位点,具有不同端基的PEG因可以(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯反应,得到单端作为连接臂在两端进行不同的反应,而应用更加广马来酰亚胺基修饰的PEG。一般来说,把氨基转化泛[9。这种不同端基的PEG可以将生物大分子连成马来酰亚胺基方法是先将氨基与马来酸酐反应酰接于基质表面,对药物进行特定位点的修饰,以及对化后再经过环合,得到马来酰亚胺基。但是,这种方纳米粒子进行功能基化用于生物检测或特定的识法使得大分子反应不完全,分离纯化难度也增加。别1013]。在PEG修饰多肽、蛋白类药物应用中,巯.本工作采取的方法不仅反应条件简单而且可以提高中国煤化工收稿日期:2011-12-29修改稿8期:2012-01-16.DHCNMHG作者简介:王婷(1986-),女,湖北潜江人,江南大学在读硕士研究生,师从倪才华教授,盂庆斌切理研究员,主要从事功能化聚合物的合成。电话:15810644025 ,E - mail:wt65298938@ 163. com通讯联系人:孟庆斌, E - mail: nankaimqb@ yahoo. com. cn;倪才华, E - mail :nicaihua2000@ 163. com第3期王婷等;单端马来酰亚胺基功能化聚乙二醇的制备439氨基PEC的反应程度同时使分离纯化简单化。发仪;DZF6020型真空干燥箱;VarianMereuryVx1实验部分400MHz核磁共振仪; API 3000型三重四极杆串联1.1 试剂与仪器质谱仪。.聚乙二醇( PEG2000)、氨基己酸、马来酸酐、叠1.2实验方法氮钠、三苯基膦、对甲苯磺酰氯、二氯甲烷、四氢呋以PEG2000为原料,先合成- -端为氨基- -端为喃、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐羟基的聚乙二醇NH2-PEC2000-0H17),再与一端为( EDC. HC1)、N-羟基琥珀酰亚胺( NHS)、无水硫酸马来酰亚胺基--端为琥珀酰亚胺的双官能团连接臂钠醋酸均为分析纯。6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯18]反应,最终Sartorius BS1 10S型电子天平; DF-101S集热式得到一端为马来酰亚胺基一端为羟基的聚乙二醇，恒温加热磁力搅拌器;EYELA0SB-2100型旋转蒸具体合成路线如下:HoAOH_TC hrotoH_ NaN_n如0Ha)(bP(h)zNHW入H H以( ~ 入,oHc)wm sooH-_- 点一(s1.2.1 Ts0-PEG2000-0H(a)的合成 圆底烧瓶中,马来酸酐和13.4 g氨基己酸,溶于50 mL醋酸,室加人称量40 g PEG2000,5.6 mL Et,N与200 mL温下搅拌反应4 h后,回流过夜。减压除去醋酸。CH2Cl。将1.9 g对甲苯磺酰氯(TsCl)溶于适量硅胶柱层析分离纯化,得到白色固体(d)10.6g,产CH2Cl2 ,缓慢滴人烧瓶中,在室温下搅拌反应,溶液率45% (展开剂CH2Cl2 :EA = 5:1,Rf = 0. 38)。由无色变为浅黄色,产物为Ts0-PEG2000-0Ts、TsO-1.2.56-( 马来酰亚胺基)已酸琥珀酰亚胺酯(e)PEG2000-0H的混合物。硅胶柱层析分离纯化,得的合成将10.62g(d) 、8.6 g NHS、14.4 g EDC●到白色蜡状产物(a)8 g,产率38% (展开剂为HCl溶于180 mL CH2Cl2, 先在冰浴下搅拌反应CH2Cl2 :CHzOH = 7:1,Rf = 0.7)。0.5h,然后在室温下搅拌反应36h,溶液变为澄清1.2.2 N;-PEG2000-0H(b)的合成 将8 g(a),浅红色。硅胶柱层析纯化分离,得到白色固体(e)0.39gNaN,,60mL乙腈在100C油浴下,搅拌回流12.3 g,产率80% (展开剂CH2Cl2 :EA = 5:1,Rf=36 h,冷却至室温,加水稀释,用CH2Cl2萃取4次,0.60)。合并有机相,加入无水Na2SO。干燥,过滤,旋干溶1.2.6 Mal-( CH2)-CONH-PEG2000-0H(f)的合成剂,得到白色蜡状物( b)6.4 g,产率80%。将2 g(c)与0.9 g(e)溶于25 mL CH2Cl2 ,室温下1.2.3 NH2-PEG2000-0H(c) 的合成将(b)搅拌反应48h,硅胶柱层析纯化分离,得到浅黄色固6.4g,三苯基膦1.68 g,水0.17 g,THF 40mL。在体(f)0.9 g,产率45% (展开剂为CH2CL :CH,OH .室温下搅拌反应48h。旋干溶剂,得到浅黄色粘稠= 6:1,Rf = 0.67)。油状物,加人35 mL的5% HCl, 室温下搅拌1 h,有2结果与讨论白色沉淀生成,过滤,除去沉淀。滤液用无水乙醚洗2.1 TsO-pEC2000_∩H 的丰纸3次,取水相,用NaOH溶液调节至pH =10,放入冰由图1中国煤化工，苯磺酰基苯环箱冷藏过夜。次日过滤除去固体,旋干溶剂,得到粗上标为b的YHCNMHG7. 34处苯环产品(c)5.8 g,粗产率90%。上标为c的两个H,显示为双峰;δ = 4. 16处与磺1.2.4 Mal-( CH2)s-C00H(d)的合成称取 10 g酰基相连的亚甲基上的两个H(标为d),显示为三440应用化工第41卷重峰;δ = 3.85 ~3.5处为PEG中亚甲基上所有H 2.4 Mal-( CH2)s-COOH的表征(标为e),显示为多重峰;δ*= 2. 45处为对苯磺酰由图4可知,在δ =6.7处为马来酰亚胺基双键基中甲基上的三个H(标为a),显示为单重峰;δ =上的两个 H(标为g) ,显示为单峰;8 =3.5处为直接7.2为CDCl,的溶剂峰。与马来酰亚胺相连亚甲基上两个H(标为a),显示为三重峰;δ=2.35处为直接与羧基相连的亚甲基上两个H(标为e),显示为三重峰;δ=1.6处为5位碳和3位碳的亚甲基上4个H(标为b和d),发生偶合,显示为多重峰;δ=1.34处4位碳亚甲基上两个H(标为c) ,显示为五重峰。在负离子模式下,产生了[M-H]~离子峰m/z=210.2,可得M =211,与预期结果-致。- -级全扫描质谱图见图5。图1 Ts0-PEG2000-0H 的核磁图谱( CDCI,)Fig.1 'H NMR spectrum of Ts0-PEG2000-0H (CDCl,)2.2 N3-PEG2000-0H 的表征由图2可知,δ=3.85 ~3.5处为PEG中亚甲基上所有H(标为b) ,显示为多重峰;δ =3.4处为直接与叠氮基相连的亚甲基上的两个H(标为a),显示为三重峰。图4 Mal-( CH2);-COOH的核磁图谱( CDCl,)nyotoy onFig.4' H NMR spectrum of Mal-( CH2 )s-C00H (CDCI,)210.2.096.3图2 N-PEG2000-0H的核磁图谱( CDCI, )1.0Fig.2 'H NMR spectrum of N,-PEG2000-0H (CDCI])69.3113.316.22.3 NH-PEG2000-OH 的表征50100 150200250300由图3可知,在δ = 3.5~3.85 处为PEG中亚甲基上的H(标为b),显示为多重峰;δ = 2. 86处图5 Mal-(CH2)s-COOH 的质谱图谱为直接与氨基相连的亚甲基上的两个H(标为a),ig.5 ESI spectrum of Mal-( CH2)s-CO0H显示为三重峰。2.5 6-( 马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯的表征由图6可知,在8=6.7处为马来酰亚胺基双键上两个H(标为g) ,显示为单峰;δ=3.5处为直接与以Y ogo on马来酰亚胺相连亚甲基上两个H(标为a),显示为三重峰;δ =2.84处为琥珀酰亚胺基.上四个H(标为f),显示为单重峰;δ= 2.6处为2位碳亚甲基上两个H(标为e) ,显示为三重峰;δ=1.78处为5位碳亚甲基上两中国煤化工:峰;δ=1.6为3位碳亚甲AYHCNMHG示为五重峰;.图3 NH2-PEG2000-0H 的核磁图谱( CDCl,)δ=1.4为4位碳亚甲基上两个H(标为c),显示为Fig.3. 'H NMR spectrum of NH2-PEG2000-0H (CDCl,)五重峰。第3期王婷等:单端马来酰亚胺基功能化聚乙二醇的制备4418图6 6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯图8 Mal-( CH2 )-CONH-PEC2000-0H核磁图谱( CDCI,)核磁图谱( CDCl,)Fig.8 'H NMR spectrum of Mal-( CH2 )-CONH-Fig.61 H NMR spectrum of 6. maleimidohexanoic acidPEG2000-0H (CDCI,)N-hydroxysuccinimide ester (CDCl,)在正离子模式下,产生了[M +H]'的准分子峰3结论m/z= 309.5, 同时产生了[M f Na]*的阳离子加和本研究以PEG2000为原料,先将单端羟基功能物m/z=331.3,可得到M =308,与预期结果- - 致。化为氨基,然后再与双官能团小分子连接臂反应,与一级全扫描质谱图见图7。单一的大分子反应相比,这样更加易于提高反应程10.0度和简化分离纯化工作。经过'H NMR检测,最终| 331.3能够成功的合成单端马来酰亚胺功能化的聚乙二8.00醇6.00参考文献:4.0010.194.3[1] Dreborg s, Akerblom E. Immunotherapy with monome-2.00216.3 309.5thoxypolyethylene glycol modified allergens[J]. Crit Rev138166.“326.4409.4 462.4Ther Drug, 1990 ,6(4) :315-365.100 150 200 250 300 350 400 450 500[2] Yamaoka T, Tabata Y, Ikada Y. Distribution and tssuem图7 6-( 马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯质谱图谱uptake of poly ( ethylene glycol) with diferent molecularFig.7 ESI spectrum of 6-maleimidohexanoic acidweights after intravenous administration to mice[J]. JN-hydroxysuccinimide esterPharm Sci，1994, 83(4) :601-606.2.6 Mal-( CH2)s-CONH-PEG2000-OH的表征[3] Zalipsky s. Functionalized poly ( ethylene glycols) for由图8可知，在δ=6.7处为马来酰亚胺基双preparation of biologically relevant conjugates[J]. Bio-键上两个H(标为g),显示为单峰;在δ= 3.4 ~conjugate Chem, 1995 ,6(2) :150-165. .3.85处为PEG中亚甲基上的H(标为f),显示为多[4Reddy K R. Cntoll release ,eglatinlipomal for-重峰;直接与马来酰亚胺相连亚甲基上两个H(标.mulations: New mechanisms in the delivery of injectabledrugs[J]. Ann Pharmacother ,2000 ,34 (7) :915-923.为a),应在δ= 3.5处有一个三重峰埋没在PEG的.[5] Harrington K J, Mohammadtaghi s, UsterPS,et al. E-亚甲基上的H的峰中;δ=2.1处为与酰胺键相连fective targeting of solid tumors in patients with locally羰基相邻的亚甲基上的H(标为e),显示为三重峰; .advanced cancers by radiolabeled pegylated liposomesδ=1.6处为连接臂上3位和5位碳上亚甲基的H[J]. Clin Cancer Res, 2001 ,7(2) :243-254.(分别标为d和b) ,显示为多重峰;δ= 1.3处为连[6]Feng X, Yuan Y J, Wu J C. Synthesis and evaluation of接臂上4位碳上亚甲基H(标为c),显示为五重峰。water-soluble paclitaxel prodrugs[ J]. Bioorg Med Chem与图6相比,图8中出现了δ = 3.4~3. 85的PEG .lett,2002 ,12(22) :3301 -03.亚甲基上的H峰,并且δ= 2. 84处为琥珀酰亚胺基[7]Thompson M, Vadala T, Vadala M , et al. Synthesis and上四个H的单峰消失,连接臂上23、4、5位碳亚甲applications of heterobifunctional poly ( ethylene oxide )基上H的化学位移向高场发生了细小迁移,说明琥oligom中国煤化工::345-373.珀酰亚胺基脱去,连接臂与聚合物已连接上,形成了[8]熊成JTY.HCNMHG術生物的合成研究进展。小同」心报1:945.酰胺键。(下转第4444页).444应用化工第41卷100参考文献:95[1] 章思规.精细有机化学品技术手册(下册)[M].北京:90科学出版社,1992 :967.2] 陈平.环己醇脱水制备环己烯催化剂综述[J].应用化80工，2004(3):3-5.[3]牛梅菊 ,崔庆新,张立云.环己醇催化脱水制备环已烯75的研究[J].化学世界,2004(8) :418420.701[4]古绪鹏,余维琴,黄玉荣.粉煤灰复合固体酸催化合成催化剂重复使用次数次环已烯的应用研究[J].化工进展,2004 ,23(2):195-图4 [ BMIm]NO,的重复使用性197.rig.4 The reusability of { BMIm]NO3[5]张敏袁先友.脱铝超稳Y沸石催化环已醇脱水制备由图4可知,随着离子液体循环使用次数的增环已烯[J].精细化工,2000 ,17(5) :287-289.加,产品的收率呈现缓慢下降的趋势,但即使在第4[6] 王兰芝,杨立静,赵笑虹,等.绿色化学理念下合成环次重复实验时,环己烯的收率仍然达到88%。说明已烯的研究进展[J].河北师范大学学报:自然科学离子液体[ BMIm]NO,在反应条件下具有较好的稳版,2009 ,33(2) :231-235.定性,其催化活性并没有随重复使用次数的增加而[7]方 东,巩凯,施群荣,等. Brpnsted酸功能化离子液体催化环己醇脱水制备环己烯[J].精细化工, 2006,23出现大幅度的降低。(1):1131-1133,1141.3结论[8] Welton T. Room temperature ionic liquids. Solvents for'(1)在环己醇脱水合成环己烯的反应中,引入synthesis and catalysis[J]. Chem Rev, 1999, 99 (8):环境友好的离子液体,以取代传统腐蚀性的酸作为2071 -2084.催化剂,详细考察了不同反应条件对产品收率的影[9] Zhou H, Shi F ,Tian X,et al. Synthesis of carbamates from响。优化后的反应条件为:反应温度180 C ,反应时aliphatic amines and dimethyl carbonate catalyzed by acidfunctional ionic liquids[J].J Mol Catal A: Chem , 2007间2 h,n([ BMIm]NO;):n(环乙醇) =1:33。在此(271) :89-92.条件下,环已烯的收率达到93%。(2)通过减压蒸馏，离子液体能够很方便的回[10] Li Y, Zhang J, Wang W,et al. Eficient synthesis oftribenzohexadehydro annulene and its derivatives in the收利用,第4次重复使用时,产品收率仍然保持在ionic liquid[J].J Org Chem ,2005 ,70 (8) :3285-3287.88%。该方法环境友好、操作简单,为环已烯的制备[11]李福枝,肖细梅,龚慧芳,等.浅谈环已烯制备实验中提供了一种新的绿色合成方法。的有关注意事项[J].化学工程与装备,2010(8):21-. (上接第441页)glycol) -gafted liposomnes : In vitro studies [J]. Bioconju-[9] Zhang S,Du J ,Sun R,et al. Synthesis of heterobifunctionalgate Chem, 1999 ,10(2) :289 298.poly ( ethylene glycol) with a primary amino group at one[14] 路娟,刘清飞，罗国安,等.药物的聚乙二醇修饰研究进end and a carboxylate group at the other end[J]. React展[].有机化学,2009(9) :1167-1174.Funct Polym ,2003 ,56(1) :17-25.[15]马金波,郄建坤,刘克良.多肽蛋白类药物聚乙二醇化[10] Chen H, Chen Y, Sheardown H, et al. Immobilization of研究进展[J].中国药物化学杂志,2005, 15(2):116-heparin on a silicone surface through a heterobifunctional120.PEG spacer[J]. Biomaterials ,2005 ,26( 35) :7418-7424.[16] Roberts M , Bentley M , Haris J. Chemistry for peptide and[11] Kleemann E,Neu M ,Jekel N ,et al. Nano carriers for DNAprotein PEGylation[J]. Adv Drug Deliver Rev , 2002 ,54delivery to the lung based upon a TAT-derived peptide co-(4) :459 476.valently coupled to PEG- PEI[ J].J Control Release ,2005 ,[17] Tamiaki H,Ogawa K ,Enomoto K,et al. Supramolecular ge-109(1/2/3) :299-316.lation of alchol and water bv svnthetice amphiphilic gllie[12] Diamente P R, Burke R D,van Veggel F C J M. Bioconju-acid den中国煤化工56(9) 1666.6gation of Ln'+ -doped LaF, nanoparticles to avidin[J].18] Song HYHC N M H Gractical synthesisLangmuir ,2006 ,22(4):1782-1788.of maleimides and coumarin-linked probes for protein and13] Gabizon A, Horowitz A T,Coren D, et al. Targeting folateantibody labelling via reduction of native disulfdes [ J].receptor with folate linked to extremities of poly ( ethyleneOrg Biomol Chem ,2009 ,7(17) :3400-3406..