乙醇对肠黏膜屏障功能的影响及作用机制

山西医药杂志2012年7月幕41卷A Shanxi Med J. July 2012. vol 41. No. 7 the Second667著乙醇对肠黏膜屏障功能的影响及作用机制中国医科大学附属第一医院(11000)终静王颖王炳元【摘要】目的探讨乙醇对肠上皮细胞屏障功能的影响及作用机制。方法将不同浓度的乙醇与肠上皮细胞株Caco2细胞共培养4h,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法及乳酸脱氢酶法(LDH)检测细胞存活率。应用Caco2细胞建立肠上皮细胞屏障模型,不同浓度乙醇溶液处理后,测定其跨上皮细胞电阻值(TEER)及荧光黄透过率的变化。应用蛋白印迹法及免疫荧光染色法检测紧密连接蛋白 occludin的表达和分布。结果乙醇浓度≤5%时,不影响Caco2细胞的生存率。乙醇诱导肠上皮细胞屏障通透性增加,呈浓度时间依赖性;乙醇作用后,细胞膜上 occludin表达逐渐降低,60min时达最低值,细胞膜上呈点状分布,此后部分可逐渐恢复,趋势与TEER值及荧光黄透过率一致。结论乙醇可破坏细胞间紧密连接蛋白,进而诱导肠上皮细胞屏障通透性增加【关键词】乙醇;跨上皮细胞电阻;紧密连接;Caco2细胞目前研究中关于乙醇致肠道通透性改变的病理培养箱中培养24b后换上含不同浓度乙醇的培养液(1%机制很多,均认为肠道通透性改变的根本原因在于25%5%7.5%、10%),每种浓度设6孔重复,以不含乙肠道黏膜的损伤。完整的肠黏膜是防止细菌移位醇的培养液为阴性对照,分组继续培养4h后,每孔加人的基础及主要屏障。实验发现在给予添加乙醇饮MTT20μ(5g/L),温浴4b,弃上清液,每孔加入DM食的大鼠中有肠道上皮细胞紧密连接的破坏,提0150L,室温避光播床上充分振荡10mi,混匀后以空示在乙醇诱导的肠道通透性改变中,肠黏膜上皮屏白孔调零,在酶标仪上检测490mm波长吸光度(A)值障遭到的破坏是可能的机制之一。每次实验重复3次。1.2.3乳酸脱氢酶(LDH)检测法:本实验采用LDH试剂材料和方法盒检测Caco2细胞经不同乙醇浓度(1%、2.5%、5%1.1材料7.5%10%)作用4h后,细胞溶质中LDH的释放进面评Caco2细胞株购自南京凯基生物有限公司,达氏修正估细胞的生存率依氏培养基(DMEM)高糖培养液及胎牛血清购自美国Hy1.2.4肠上皮细胞屏障通透性的检测:Caco2细胞形成单clone公司,四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国 Sigma公层上皮细胞屏障后,在 Transwell 2基底侧加入不同浓度的乙甲基亚砜(DMSO)购自北京索莱宝科学技术有限公司醇(1%2.5%5%),孵育不同时间(0、15、30、60、120、180occludin抗体购自北京博奥森公司、美国 Santa Cruz公司240min),观察加人乙醇前后Caco2细胞TEER的变化情荧光黄购自美国 Sigma公司况,并测定加入乙醇后Caco2细胞对荧光黄透过率的改1.2方法变。每种实验均选取4组非同代细胞进行。①TEER的测1.2.1体外肠上皮细胞屏障模型的建立:分化良好的Caco2细胞接种于 Trans-well板上(孔径3pm,有效膜面积定:应用细胞电阻仪(EVOM)测定加入乙醇前后Caco2细胞的TEER测定方法参照文献[1],为保证数值的准确1.12cm2),接种密度为1×105/cm2,隔天换液( Transwell上层加入600L培养液下层加入1800μL培养液),倒置性,整个过程在恒定温度下(37℃)进行,每个 Transwell均显微镜下观察细胞生长情况,同时测定跨上皮细胞电阻取不同方向的3个点重复测定3次。②荧光黄透过率的(TEER)。约21~24d细胞形成紧密单层TEER明显升检测:应用荧光黄作为标记物检测乙醇对Caco2细胞细高,证明肠上皮细胞屏障形成胞旁转运的影响。细胞用Hank平衡盐溶液(HBSs)(pH1.22MTT比色实验:将处于对数生长期的细胞,用7.4)小心冲洗3次,37℃孵育30min,吸净孔内的HBSS以25%胰蛋白酶消化后以每孔1×10加入96孔培养板防止干扰;在 Transwell顶端加入408/mL荧光黄,37℃中,每孔体积10,置于37℃,体积分数为5%C02的朝育1b后收集基底侧液体,荧光分光度计下测定吸光度(激发波长427nm,发射波长536nm),根据标准曲线计算荧光黄浓度基金项目:辽宁省科技厅高等学校科研項目(2009A809)1.2.5蛋白印迹法检测紧密连接相关蛋白表达:当Tran通信作者;王炳元,Email:wangby@medmail.com.cnswell小室的上室细胞生长至融合时,用含有0.1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)不含钙、镁离子的磷酸盐缓冲液山西医药杂志2012年7月第41卷第7期下半月 Shanxi Med J,July2012,Vol.41,No.7 the second(PBS)冲洗,细胞铲小心刮取细胞,倒人1mL裂解液A(2测结果提示(检测时间4h),当乙醇浓度≤5%时,Caco2细mmo/ L EDTA,10mmol/L乙二醇双醚四乙酸(EGTA),胞处理组生长抑制率与对照组相比差异无统计学意义(P>0.4%NaF,20mmol/ L Tis-Hcl,蛋白酶抑制剂混合物,苯0.05);当乙醇浓度>5%时,细胞生长抑制率随乙醇处理浓甲基磺酰氟(PMSF),1% Titon x100,pH7.5),4℃匀度升高而显著升高,与对照组比较差异有统计学意义(P<浆,离心,上清液为蛋白样品液。加入抗 occludin抗体(1:0.05或P<0,01)。LDH试剂盒检测结果提示(检测时间4100),抗β肌动蛋白抗体(1:5000,4℃孵育过夜,在羊h),当乙醇浓度≤10%时,Caco2细胞处理组生长抑制率与抗兔辣根过氧化物标记的IgG二抗中37℃孵育45min,化对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。见表1学发光(ECL),X线片曝光、显像,所得胶片用 Chemi Ima表1各组MTT比色法及LDH法检测ger5500V3.0软件扫描,通过 Fluor Chen2.0软件进行定细胞生存率(%)(x±s)量分析,测得A值组别醇MTT比色法LDH法1.2.6免疫荧光观察紧密连接相关蛋白 occludin的表达照组00.0±1.0100.0±1,1和分布:依照不同的实验组,将生长在盖玻片上Caco2单1%乙醇组99.9士0.499.1±1.02.5%乙醇组9.9±0.9100.4±3.5层用4%的多聚甲醛固定30min,用0.5% Triton X-100透5%乙醇组99.5±4.299.2±1.9化5min,用5%牛血清白蛋白(BsA)封闭1h。抗体稀释7.5%乙醇组73.6±5.201,0士4.3度: occludin(1:60),阴性对照用0.01mol/LPBS代替一10%乙醇组48.3土3.498.6±士5.1抗,4℃孵育过夜。应用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的荧2.2乙醇对Cac2细胞的屏障功能的作用:为了确定乙光二抗(1:100)孵育1h,避光操作甘油封片,荧光显微镜醇在不破坏Caco2细胞膜的情况下是否对细胞的屏障功观察,采集图像。能有直接的损伤作用,本实验观察了乙醇对培养的Caco21.3统计学处理细胞紧密连接的作用。测定不同浓度乙醇对肠上皮细胞屏所有数据以王士s表示,2组间采用t检验,多组间比较障作用不同时间的TEER变化,见表2。检测不同浓度乙采用重复测量的方差分析和 Bonferroni检验,P<0.05为醇作用不同时间的荧光黄透过率的变化,见表3,发现肠上差异有统计学意义皮屏障通透性增加,呈时间浓度依赖性,作用60min时2结果TEER值达最低值,荧光黄透过率达峰值,此后可逐渐恢2.1乙醇对Caco2细胞的生长抑制作用:MTT比色法检复2各组不同时间肠上皮细胞屏障通透性(TEER值)(x士s)n/cm215n1%乙醇组387.0±3.9372.7±3.4357.6±2.9348.7士4.0350.8士4.3361.2±4,8374,8±5.22.5%乙醇组3.9士4.8362.9士2.9348.13.3327.6士3.4346.5士5.23578士46372.7士4.45%乙醇组383.6士4.7348.9士2.9334.3±3.6311.9士5.6335.8±4.26.0±3.9370.2±4.4表3各组不同时间肠上皮细胞屏障通透性(荧光黄透过率)(%)(x±s)组别15 min30 min60 min20 min180 min240 min1%乙醇组0.99±0.258.00士1.0512.15±0.5214.50±0.3775士0.3710.75±0.328.50±0.472.5%乙醇组0.99±0.258.60士0.4914.20±0.3916.80±0.3614.30±0.4012.20±0.338.90士0.485%乙醇组0.99士0.259.00士0.3417.00士0.3719.80士0.4318.80士0.5114.90士0.369.30±0.282.3乙醇作用后肠上皮细胞间紧密连接蛋白 occludin表蛋白的重分布:免疫荧光分析显示,在未处理的细胞中,oc达水平显著减低:通过前期研究,选择不影响Caco2细胞 cludin位于细胞膜上,且呈连续性分布。乙醇处理60min生存率且明显增加肠上皮细胞屏障通透性为原则故选择时, occludin在细胞膜上表达水平降低,由细胞膜向细胞质5%乙醇为作用浓度进行以下实验。结果显示,5%乙醇作内转移,部分断裂消失。乙醇处理180min时,可见细胞膜用过程中, occludin表达水平逐渐降低,60min时达最低值,上 occludin蛋白表达部分恢复。此后逐渐恢复.60min组 occludin 3白表达水平与其他各3讨论组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1肠黏膜上皮屏障是构成机体内外环境之间的preludin一种机械保护作用的组织学屏障,在防止病原微生物从黏膜侵入方面有着非常重要的作用。肠黏膜12345678上皮屏障主要由两部分组成,肠黏膜上皮细胞及其1:对照组;2:0min组;3:30min组;4:60min组;5:120min组;6:180min组;7:210min组;8:300min组周围的紧密连接。紧密连接由相邻细胞膜处各种图1蛋白印迹法检测各组 occludin蛋白的表达蛋白质的相互作用所构成2,其中 occludin是最主2.4乙醇诱导肠上皮细胞屏障紧密连接相关蛋白 occludin要的跨膜蛋白。正常情况下,紧密连接通过调控作山西医药杂志2012年7月第41喜第7期下半月 Shanxi Med J,July2012.vol.41,No.7 the second·669用,选择性地转运相应物质而有效地阻止肠腔内峰值,此后逐渐恢复。通过蛋白印迹法及免疫荧光细菌、毒素及炎症介质等物质的旁细胞转运维持染色法检测细胞间紧密连接蛋白 occludin表达水肠黏膜上皮屏障功能的完整平与TEER值及荧光黄透过率趋势一致。FishSwanson等和Rao3报道乙醇可致肠上皮er证明了紧密连接与TEER直接相关,更加支持屏障功能障碍,使小肠黏膜通透性增加。然而,肠我们的结论:乙醇可通过破坏Cac2细胞紧密连上皮屏障功能的改变是由于乙醇直接损伤肠黏膜接的完整性进而增加肠上皮屏障通透性。细胞引起的还是损伤细胞间紧密连接所致有待进综上所述,乙醇浓度≤5%时可短暂性破坏细步详细阐明。本实验首先通过MTT比色法及胞间紧密连接,导致肠黏膜屏障通透性增加;当5%检测LDH来评价乙醇对Caco2细胞生存率的影<乙醇浓度≤10%时,可使肠上皮细胞发生脱落,响。MTT可被活细胞线粒体上琥珀酸脱氢酶转化可能与细胞间紧密连接破坏程度较严重有关。上成蓝紫色甲臢颗粒此颗粒被DMS溶解后用分光述具体机制很复杂,有待于进一步研究。光度计测定出A值,A值的大小与活细胞数呈正参考文獻相关。我们在MTT实验中发现,乙醇浓度在不1] Schmitz H, Fromm M,Bnal,eta. Tumor necrosis fac-超过5%时,与对照组相比细胞生存率影响差异无tor-alpha(TNF alpha) regulates the epithelial barrier in the统计学意义(P>0.05),如超过5%时,细胞首先human intestinal cell line HT-29/B6. J Cell Sci. 1991.12(P发生脱落,影响细胞生存率的检测结果。而LDH[2] Anderson JM, van Itallie CM. Tight junctions and the mol试验是用紫外分光光度仪测定乳酸盐的含量。因lar basis for regulation of paracellular permeability. Am J仅使用培养细胞的废液来进行,故不受细胞脱落、Physiol,1995,269:467-475漂浮等因素的影响。我们在LDH实验发现,乙醇[3]邹仲之,组织学与胚胎学,6版北京:人民卫生出版社,2005:15-18浓度不超过10%与对照组相比细胞生存率影响差[4 Swanson G, Forsyth CB, Tang Y, et al. Role of intestinal ci异无统计学意义(P>0.05)。证实乙醇浓度≤5%dian genes in aleohohinduced gut leakiness, Alcohol Clin Exp时不影响细胞生存率;5%<乙醇浓度≤10%时Res2011,35(7);1305-1314Caco2细胞发生脱落而细胞未出现破裂而导致细5] Rao r. Endotoxemia and gut barrier dysfunction in alcoholic胞死亡,可能与细胞间紧密连接蛋白损伤严重程度liver disease. Hepatology, 2009, 50(2): 638-644较大有关。[6]成惠林,刘承基检测细胞活性的MTT方法江苏医药,1996,22(5):330-33通过前期试验乙醇浓度选择5%,进行后续实(7]Ftrs. Swaan PW, Eddington nd,el. The ethanol验,检测体外肠上皮屏障通透性。本实验中通过tabolite acetaldehyde increases para-cellular drug permeabilityTEER及荧光黄透过率来检测肠上皮屏障通透性in vitro and oral bioavailability in vioo. J Pharmacol Exp TherTEER是检测细胞屏障的指标,其值越大代表细2010,332(1):326333胞的屏障功能越好。而荧光黄透过率实验检测肠(收稿日期:20120406)上皮屏障通透性,较TEER实验更准确,不易受外作者简介:俸静,女,1979年11月生,主治医师,中国医科大学附禹第一医院,110001界因素影响。本实验发现乙醇作用后,肠上皮屏障通透性增加,呈时间浓度依赖性,作用60mn时达