苎麻纤维质酶降解生产生物燃料乙醇的工艺

第23卷第4期农业工程学报2007年4月Transactions of the CSAEApr.2007苎麻纤维质酶降解生产生物燃料乙醇的工艺彭源德,郑科,杨喜爱,严理,唐守伟,朱爱国,熊和平(中国农业科学院麻类研究所,长沙410205)摘要:在微生物预处理兰麻韧皮的基础上,进行了pH值、酶用量、葡萄糖浓度和原料处理方式等对苎麻纤维质酶降解的单因子试验和正交试验。结果表明,苎麻纤维质酶解的起始pH值为50左右,总糖转化率最高,达72.361%在一定的酶浓度范围内,随着酶量的增加,苎麻纤维质的总糖转化率提高,酶的适宜用量为:木聚糖酶5%纤维素酶10%水解液中葡萄糖浓度在0.5%以下时,苎麻纤维质的总糖转化率不受影响,葡萄糖浓度在05%以上时,随着水解液中葡萄糖含量的增加,总糖转化率下降;些麻纤维质酶解过程中,对原料进行机械处理有利于提高酶的水解效率;兰麻纤维质酶解的最适条件为;pH值4.5~5.5、纤维素酶浓度8%~11%葡萄糖浓度小于0.5%、原料不洗直接进行剪碎处理关键词:苎麻;纤维质;酶降解;影响因素中图分类号:S216.2文献标识码:A文章编号:1002-6819(2007)4-0006-05彭源德,郑科杨喜爱,等.苎麻纤维质酶降解生产生物燃料乙醇的工艺[]农业工程学报,2007,23(4):6-10.Peng Yuande, Zheng Ke, Yang Xi'ai, et al. Technology for producing bio-ethanol from ramie lignoellulosic degradationwith enzymes[]. Transactions of the CSAE, 2007, 23(4): 6-10. (in Chinese with English abstract)解得糖率为45,3%~54.5%,全纤维素转化率平均为0引言73.8%;沈金龙等(2004)利用纤维素酶高产菌株里氏木随着化石燃料等不可再生资源的逐步消耗殆尽,开霉突变株813A所产生的纤维素酶,对天然木质纤维素发利用可替代能源为当务之急。近年来,国内外学者广的水解糖化过程进行了研究,玉米叶和杨树叶的水解糖泛开展了植物纤维质如玉米秸秆、甘蔗渣、柠檬酸渣酒化率分别达到86.12%和56.10%酒精转化率79.14%糟、稻壳等通过生物转化得到燃料乙醇的研究-1,以~72.11%。但由于受硫酸预处理的环境污染严重,植物纤维质原料生产乙醇的关键环节之一是将纤维素酶的活力不高技术不完善等因素的影响导致纤维质和半纤维素水解为单糖,即糖化过程,而酶糖化技术是生产燃料乙醇的产业化进程缓慢作者采用微生物预处被普遍看好的糖化工艺。例如加拿大的 logen公司,利理和酶降解糖化技术,将苎麻纤维质酶降解生产燃料乙用从遗传工程真菌所制成的纤维素酶有效地使纤维素醇取得重要进展。前文报道了外界因子对纤维质酶水解为葡萄糖和其它糖类1。 Zoned等(1991)利用纯降解的影响。本研究拟在此基础上,通过研究起始pH化的葡萄糖苷酶和纤维素酶同时酶化纤维素,大大提值、酶和葡萄糖浓度及原料物理处理方式等主要因素对髙了糖化速率ω;Hari等(2000利用模式菌种里氏木苎麻纤维质酶降解的影响,优化酶降解的条件,确定苎霉( Trichoderma reesei)QM-9414产生的纤维素酶对麻纤维质酶解糖化的工艺流程和技术参数,为加速研究香蕉叶子进行降解,获得了较高的糖化率。国内,木苎麻木质纤维素生产燃料酒精酶糖化技术改良酶促反质纤维素等生物酶降解生产燃料乙醇的研究刚刚起步。应条件(如除去某些酶解产物降低酶促反应平衡点)研张发群等(1991)糖化蔗髓时,先用CaO处理,再经究等方面提供科学依据,进而充分挖掘中国特有的苎麻Trichoderma Uoningji P2菌株所产生的酶液进行分纤维质资源,缓解能源紧张的矛盾,达到保护生态环境的目的。基金项目国家948项目(206-618)中国农业科学院科技经费课1材料与方法题和湖南省麻类作物遗传育种与麻产品生物加工重点实验室课题“苎麻生产燃料酒精的酶糖化技术基础研究”的部分研究内容1.1材料作者简介:彭源德(1965-),男,研究员,主要从事农产品生物加工研究。长沙中国农业科学院麻类研究所410205 Email: ibepyd313中国煤化工与环保研究室选育并蛋通讯作者,和平,研究员,博士生导师,研究方向为麻类酶加工保藏CNMHG研究。长沙中国农业科学院麻类研充所410205, Email: Ramiexhp2)纤维素酶和木聚糖酶@2118由湖南尤特尔生化有限公司提供的液体纤维素酶第4期彭源德等:苎麻纤维质酶降解生产生物燃料乙醇的工艺和木聚糖酶,其活性分别为2000IU/mL和6000种处理方式,进行苎麻纤维酶水解糖化。IU/mL左右3)正交试验3)主要仪器与设备在苎麻纤维质酶水解糖化过程中,对起始pH值、分析天平、精密pH计磁力加热搅拌器、分光光度酶和葡萄糖浓度及原料物理处理方式等4个因素,进行计、摇瓶机、生化培养箱、高速组织捣碎机、电热恒温水3个水平的正交试验。以确定影响苎麻纤维质酶水解糖浴锅、计时器、移液器和微量进样器等。化的最大因素,找出最佳工艺条件。正交设计表中水平4)化学试剂与因子L(34)各因素的取值范围见表1,按L(34)安排试验涉及的主要化学试剂有:CMC( sigma的试验计划见表2c-5678)、木聚糖、聚半乳糖醛酸、无水葡萄糖、柠檬酸表1正交试验因素水平设计L,(34)磷酸氢二钠缓冲溶液、氢氧化钠溶液、盐酸、硫酸、3,5-Table 1 Factors and levels of orthogonal test L,(3)二硝基水扬酸、酒石酸钾钠、高锰酸钾和草酸钠等,工艺水平辅料主要包括菌种活化、扩大培养和发酵的培养基组分等,这些物质均为市售商品。纤维素酶浓度/%111.2方法葡萄糖浓度/%原料处理方式不洗剪碎洗净不剪1)预处理用Ym68菌株对苎麻韧皮进行预处理,即利用微表2试验计划表生物酶催化,分、降解生苎麻中的非纤维素物质准确称Table 2 Design of test arrangement取苎麻韧皮10.0000g,按20%(对苎麻韧皮)的接种量,将培养5~6h的高效菌株Ym68°接种到生苎麻试验号pH值纤维素酶浓度葡萄糖浓度/%原料处理方式上;在35C左右条件下,静置湿润发酵6~8h,洗净备1231(4.5)1(4.5)2(0.5)2(不洗剪碎)用1(4.5)3(11)3(5)3(洗净不剪)2)单因子试验2(0.5)3(洗净不剪)采用500mL锥形瓶盛微生物预处理后的苎麻纤2(81(不洗)维质10g左右,混合酶水解时,木聚糖酶用量5%纤维素酶用量10%(以酶液对苎麻纤维的质量%表示),浴5678(5.5)3(11)1(0)2(不洗剪碎)1(5)3(5)2(不洗剪碎)3(6.5)1()3(洗净不剪)比1:10,pH值5.5,置50℃恒温处理5h;纤维素酶水3(6.5)3(11)2(0.5)1(不洗)解时,酶用量为10%(以酶液对苎麻纤维的质量%表示),浴比1:15,pH值4.5,置50℃恒温处理6h;3次4)测定方法重复,测定处理前、后液体中的还原糖量。还原糖的测定采用DNS比色定糖法(540nm);pH根据研究目的设置pH值温度、原料处理方式、值用PHS3C型酸度计测定;酸性纤维素酶活性测定采葡萄糖浓度等对苎麻纤维质酶降解糖化的影响试验。用CMC法;木聚糖酶的酶活测定采用DNS法,底物为1)纤维质糖化的起始pH值试验:分别设置pH值 sigma公司生产的木聚糖。为45、5.05.5、6.06.5和7.0,进行苎麻纤维质的混2结果与分析合酶(纤维素酶和木聚糖酶)和纤维素酶的水解糖化,测定水解液前后的还原糖量。2.1起始pH值对纤维质水解糖化的影响2)酶的用量试验:木聚糖酶用量分别为2%5%pH值对纤维质水解糖化的影响结果列于表3,从和8%,纤维素酶量分别为5%10%和15%单一纤维表3可以看出,pH值在4.5~6.5之间时,苎麻纤维质素酶用量均为10%,进行苎麻纤维质的混合酶(纤维素的糖化率没有极显著差异,以pH值5.0的糖化率最酶和木聚糖酶)和纤维素酶的水解糖化,测定水解液前高,酶活性最大;在pH7.0时,糖化率极显著降低。因后的还原糖量。此,可以得出,5.0是苎麻纤维质酶水解糖化的最适pH3)葡萄糖浓度试验:在苎麻纤维质水解糖化时,分值,总糖转化率为?361%别加入0.5%、2%、5%和8%的葡萄糖、以未添加葡萄2.2中国煤化工糖的为对照,测定起始和终点的还原糖量。CNMHG度范围内,随着酶量4)原料处理方式:设置微生物预处理后的苎麻纤的增加,酶的水解效率提高。木聚糖酶由2%增加到维质直接酶水解、剪碎成0.5cm、捣碎和风干剪碎等四5%纤维素酶从5%提高到10%糖化率提高近9个百农业工程学报2007年分点,有极显著差异;但木聚糖酶和纤维素酶的酶量再高,达72.622%;其次是剪碎处理的;再次为湿润纤维分别增加到8%和15%时,糖转化率几乎没有差异。这质直接水解糖化的,糖化率为62.066%;风于剪碎处理是由于在一定条件下,一定量的半纤维素和纤维素分子的糖化率最低仅为32.003%这可能是由于酶吸附于能和酶分子结合的结合点数有限,当这些结合点全被酶纤维素表面是纤维素发生水解的必需条件,机械处理使分子占据后,酶分子处于饱和态,再增加酶用量,也起不纤维素的比表面积增加,有利于纤维素酶的吸附,进而到酶解作用因此,从经济角度考虑,酶用量以木聚糖酶提高酶的水解效率95%和纤维素酶10%比较适宜。表6原料物理处理方式与总糖转化率的关系表3pH值对苎麻纤维质水解总糖量的影响Table 6 Relationship between methods of materialTable 3 Effects of pH value on ramie lignocellulosictreatment and the rate of saccarification /degrading with enzymes原料处理方式不处理剪碎捣碎风干剪碎60.64568.86171.20929.181重复I6.42327.1586.70915.96765.66155.4473重复160.07158.3174.03534.274重复I6.9847.31646,84566.18645.95145.4571重复5,48261.71572.832555平均6.70367.23616.77746.0775.80655.45222.06662.96272.62232.0030. 05 abeda=0.0515.31(<0.0023)F值9,88(<0.0001表4酶用量对总糖转化率的影响2.5正交试验Table 4 Effects of enzymes concentration on ramie从pH值、纤维素酶和葡萄糖浓度及原料处理方式gnocellulosic saccharification等因素的正交试验结果表7可以看出,4种因素对苎麻酶用量2、CX-5、C-10X-8,C-15纤维质酶降解的糖化率均有影响,以葡萄糖浓度的极差重复I66.72257.985最大,为16.54%;其次是原料处理方式,为12.28%;再重复56.42664.343次为起始pH值,极差8.61%;纤维素酶浓度的极差最重复■小,仅为8.59%。也就是说,苎麻纤维质酶降解中的葡53.68462.343萄糖浓度对总糖转化率的影响最大,原料处理方式次之,纤维素酶浓度的影响最小。从表7还可以看出,正交F值7.87(<0.0211)试验中,各因子对苎麻纤维质酶降解的糖化影响效果注XC分别表示木聚糖酶和纤维素,X-2C-5分别表小2%的木单因子试验的基本一致,其酶降解的适宜条件为:pH聚糖和5%的纤维素,如此类推。值4.5~5.5、纤维素酶浓度8%~11%葡萄糖浓度小2.3葡萄糖浓度的影响于0.5%、原料进行不洗剪碎处理。葡萄糖含量对纤维素降解的影响如表5所示,水解表7苎麻纤维质酶水解过程中主要影响因素液中葡萄糖浓度在0.5%以下时,苎麻纤维质的总糖转的正交试验结果化率不受影响;葡萄糖浓度在0.5%以上时,随着水解Table 7 Results of orthogonal test on major influence factorsduring ramie enzymatic lignocellulosic degrading液中葡萄糖含量的增加,总糖转化率下降;当葡萄糖浓实验H纤维素酶葡萄糖浓度原料处理糖化率度为8%总糖转化率下降了64%左右。浓度/%表5萄糖(G)含量对纤维素降解的影响1(0)Table 5 Effects of glucose concentration on ramie21(4.5)2(8)2(0.5)2(不洗剪碎)60.83(4.5)3(11)3(5)3(洗不剪)37.84lignocellulosic saccharification(5.5)1(5)2(0.5)3(洗不剪)42.3G浓度/%5.5)3(5)1(不洗)30.25总糖转化率/%67.4968.61576538.1224.332(5.5)3(11)1(0)2(不洗剪碎)62.39(5)3(5)2(不洗剪碎)32.923(6.5)l(0)3(洗不剪)39.162.4原料处理方式3(112(0.51(不洗)苎麻纤维质不同处理方式的酶水解糖化效果列于中国煤化工4.5表6,表6结果表明,生物脱胶后的苎麻纤维质处理方CNMHG39.77式对酶水解糖化有明显的影响,机械处理可加速纤维质8.61酶水解糖化进程,糖化率提高。以捣碎处理的糖化率最第4期彭源德等:苎麻纤维质酶降解生产生物燃料乙醇的工艺3结论与讨论中南民族学院学报(自然科学版),1995,14(1):36-3[5]李盛贤,贾树彪顾立文.利用纤维素原料生产燃料酒精的在微生物预处理苎麻韧皮的基础上,在实验室条件研究进展[].酿酒,200532(2):13-16.下进行pH值酶用量、葡萄糖浓度和原料处理方式等6]李稳宏吴大雄,高新,等麦秸纤维素酶解法产糖预处对苎麻纤维质酶降解的单因子试验和正交试验,可以得理过程工艺条件[].西北大学学报(自然科学版),1997出如下结论:1)兰麻纤维质酶解的起始pH值为50左27(3);227-230右,总糖转化率最高达72.361%。2)在一定酶浓度范7宋安东,张建酸,吴云汉利用酒槽生物质发酵生产燃料乙围内,随着酶量的增加,苎麻纤维质的总糖转化率提高,醇的实验研究[].农业工程学报,2003,19(4):278-281.酶的适宜用量为:木聚糖酶5%、纤维素酶10%。3)水[8]许风,孙润仓,詹怀宇,木质纤维原料生物转化燃料乙醇解液中葡萄糖浓度在0.5%以下时,芝麻纤维质的总糖的研究进展[J].纤维素科学与技术转化率不受影响;葡萄糖浓度在0.5%以上时,随着水〔9]杨斌吕燕萍高孔荣等蔗渣水解液发酵乙醇的研究[].生物工程学报,1997,13(4):380-386.解液中葡萄糖含量的增加,总糖转化率下降。4)苎麻纤[10张建安,张小勇韩润林等木素对纤维素酶解的影响及维质酶解过程中,对原料进行机械处理,有利于提高酶纤维素酶解[].化学工程,200028(1)137-39,43.的水解效率。5)苎麻纤维质酶解的最适条件为PH值[1]刘家健,陆怡,预处理对纤维素酶降解影响的研究U4.5~5.5、纤维素酶浓度8%~11%葡萄糖浓度小于林产化学与工业,199515(3):67-710.5%、原料不洗直接进行剪碎处理。[12]刘超纲.分批添纤维素酶水解研究[]林产化学与工业,苎麻具有生物学产量和纤维素含量高、木质素含量1996,16(1):58-61低等特点,是生产燃料乙醇的理想原料之一。本文通过[13] Katharine Sanderson. US biofuels: A field in fermentI高效清洁的预处理(6~8h完成生物发酵)和适宜的酶Nature,2006:673-676促反应条件研究获得了较高的糖化率(72%),为苎麻[14]综述秸杆酒精产业[DBOL].htp://log. bioon.cn/纤维质酶降解生产燃料乙醇技术提供了依据。同时,根user1/465/archives/ 2005/25847. shtml据本研究中纤维素酶和木聚糖酶的用量,估算出每吨燃[15]黄祖新陈由强陈如凯.甘蔗渣的酶降解研兖进展[]甘料乙醇所需酶的成本在2000元左右。这与前人研究的蔗,2004,11(4):52-56.酶解成本约占总纯生产成本的40%~55%结论基本[16] Krishna S H, Sekhar R, Suresh B,etal. Studies on the一致。通过提高酶的活性,减少酶的用量;优化酶解条production and application of cellulase from Trichoderma件,提高酶的效率是降低苎麻纤维质酶降解生产燃料乙reesei QM-9414DJ. Bioprocess Engineering, 2000,22:467醇成本的关键。470[17]沈金龙,毛爱军,王远亮,等.纤维素酶在木质纤维素生物[參考文献]质转化中的应用研究[]微生物学报,2004,44(4),507[1]邓良伟.纤维素类物质生产燃料酒精研究进展[.食品与发酵工业,1995,21(5):69-72.[18]彭源德郑科,杨喜爱,等._麻纤维质酶降解生产燃料[2]段钢,孙长平.酶在生物质转化为燃料酒精中的应用乙醇技术研究-1[].中国麻业,2006,(4[J].食品与发酵工业,2005,(5)[19] Sinitsyn A P, Gusakov A V, Vlasenko E Y. Effect of[3]傅其军燃料酒精的发展前景[J]广西轻工业,2001,(2)structural and physicochemical features of cellulosicthe efficiency of enzyhydrolysis[J][4]李步海,孙小梅郝文颖.酶解蔗渣蒸汽预处理研究[]Appl Biochem Biotechnol, 1991, 30:43-59.中国煤化工CNMHG10农业工程学报2007年Technology for producing bio-ethanol from ramie lignocellulosicdegradation with enzymesPeng Yuande, Zheng Ke, Yang Xiai, Yan Li, Tang ShouChangsha, Hunan 410205, China)Abstract: After being pretreated on ramie bast fiber by microbial retting, both single factor and multi-factorswere experimented during ramie lignocellulosic degrading with enzymes, these influential factors are pH valueconcentrations of enzymes and glucose, and methods for material treatment. The results show that, the highestrate of saccharification reaches 72. 361% at the beginning of pH 5. 0, Within a range of enzymes concentration,the rate of saccharification can be increased with the increase of enzymes; The optimal enzyme concentrations are5% of xylanase and 10%of cellulase, respectively The rate of saccharification is not influenced as glucose con-centration in the solution of lignocellulosic degrading is below 0.5%, and as over 0. 5% of glucose concentrationand with the increase of glucose in the solution, the rate of saccharification is decreased Mechanical treatment onaterial is beneficial for improving the efficiency of enzymatic degrading. The most optimum conditions for ramieenzymatic lignocellulosic degrading is pH 4.5-5.5, 8%-11% of cellulose concentration, below 0. 5% of glucoseconcentration and treatment of scissorssed and unwatered materialKey words: ramie; lignocellulose; enzymatic degrading influential factors中国煤化工CNMHG