甲醇酵母PEG和电转化法

第24卷第3期河北大学学报(自然科学版Vol 24 No. 32004年5月Journal of Hebei University(Natural Science Edition)May 2004甲醇酵母PEG和电转化法李亚东,王会文,赵晓瑜(河北大学生命科学学院河北保定071002摘要:利用电击法和PEG法分别转化甲醇酵母,电击法的转化率达(DNA)400转化子/四,明显高于PEG法,后者仅为0~20转化子/四g,而且操作更加快捷关键词:甲醇酵母;转化;电穿孔;PEG中图分类号:Q812文献标识码:A文章编号:1000-1565(2004)03-0299-02甲醇酵母( Pichia pastoris)是集真核生物和原核生物表达系统的优点-3于一身的新一代表达系统:它既具有原核生物的易于培养繁殖快、便于基因工程操作等优点,又具有真核生物翻译后的修饰加工机制,尤其可对表达的蛋白质进行简单的糖基化修饰因此对于蚯蚓纤溶酶( Earthworm FibrinoLytic Enzymes,EFE)这一真核生物的糖蛋白而言酵母表达系统无疑是较理想的表达体系由于酵母有细胞壁结构复杂,因此质粒向酵母的转化不同于大肠杆菌经典的方法是通过制备原生质体进行转化4,利用PEG(聚乙二醇)是近年来发展的一种较为简便的方法,该法操作比较简单,但其转化率与PEG的相对分子质量大小有很大的关系,而且转化率较低采用电击法,不仅操作更加快捷,而且转化率也大大提高1材料与方法1.1材料甲醇酵母GS15;pPIC9K( Invitrogen公司);LN-101基因脉冲导入仪(天津理工学院1.2方法1.2.1构建含有EFE基因片段的p9K-EK7质粒根据EFE活性最佳组分的N-末端设计简并引物,以蚯蚓( Eisenia foetida)dNA为模板,通过PCR获得该组分的编码DNA片段并克隆到 pPIC9K质粒中构建成p9K-EK7质粒1.22电击法将p9K-EK7质粒转化到甲醇酵母接100uL甲醇酵母GS15于10 mL YPD中,30℃培养过夜第2天1%接种量转接至YPD中,30℃培养至菌液浓度达OD0=1.0左右取1.5mL菌液,室温5kr/min离心1min,用1mL无菌冰水洗2次,再用1mL(1mOl1L)预冷的山梨醇洗一遍最后用01mL(1mo/)预冷的山剩醇重新悬浮细胞将20μL(约5pg)经线性化的p9K-EK7质粒与80μL细胞混匀,置于0.2cm的电转杯中冰浴5min.在7500V/cm下,分别以5,10,20pF电容进行电击转化电击后迅速加入0.2mL(1moL)山梨醇涂MD平板,30℃培养3~5d1.2.3PEG/Cl法转化p9K-EK7质粒于甲醇酵母按12.2培养甲醇酵母GS115至菌液浓度达OD0=1.0左右取0.5mL菌液,室温2 kr/min离心5min弃上清用0.5mL无菌水重新悬浮菌体,室温2kr/min离上:田05mL(0.1molL)中国煤化工收稿日期:2003-09-01CNMHG作者简介:李亚东(1977-),男,河北滦平人,河北大学在读硕士研究生300河北大学学报(自然科学版)2004年LC洗2遍用转化液(24pL50%PFG6003.6μ L I mol/L LiCl;2.5μL牛胸腺DNA;6线性质粒,加水定容至36μL)悬浮菌体并混匀,30℃保温30min,42℃再保温25min,室温2kr/min离心5min,弃上清.用0.1mL无菌冰水悬浮菌体,混匀后涂MD平板,30℃培养3~5d2结果与讨论2.1电转化法转化甲醇酵母电转化法是利用髙压电脉冲使细胞膜发生瞬间的可逆穿孔,从而使游离的外源基因穿过细胞膜而转移到细胞中去电穿孔操作对受体细胞产生的干扰很小,从而保持了活细胞的正常生理条件这是一种很有前途的基因转化方法,目前已广泛应用于细胞工程和基因工程方面本实验中使用LN-101基因脉冲导入仪,采用7500V/m的电压,0.2cm间距的转化杯对甲醇酵母GS15进行电击转化,发现在所采用的3个电容(5,10,20pF)中,电容为10m时的转化率最高,转化率(DNA)约为400个转化子/p电击法转化结果如图1所示转化组对照组图1电击法转化后MD平板生长情况Fig 1 Efficiency of electric transformation for GS115实验中使用的电击转化仪为天津理工学院生产,与功能类似的国外产品相比,具有价格便宜的优点,且转化后出现的阳性克隆的数量完全可以满足下一步实验的需要22PEG法转化甲醇酵母虽然电击转化方法具有转化效率高、简便等优点但毕竟还需要特殊的电转化设备本实验中也采用PEG/LiCI法转化,并获得成功值得注意的是在该法中PEG是个关键的因素:除了浓度以外,PEG相对分子质量的大小对转化有很大影响,直接关系到转化能否成功本实验曾先后使用PEG1500,PEc4000和PEG6000进行转化,但只有PEG6000得到了转化子与电击转化法对照该法的最大缺点在于转化效率较低转化率(DBA)一般在0~20转化子g,仅为击法的1%-5%原因主要在于甲醇酵母细胞存在较厚的细胞壁仅用PEGC诱导使外源DNA穿过厚厚的细胞壁进入细胞相对比较难因此对于甲醇酵母表达系统来说,利用电击转化比较合适[]王会文赵晓瑜甲醇酵母基因表达系统[生命的化学,2000,20(6):271-272[2]戴秀玉.一种值得注意的基因表达系统一巴斯德毕赤氏酵母[J[3]彭毅,步威康良仪甲醇酵母表达系统[生物技术通报,20中国煤化工4]卢圣栋现代分子生物学实验技术[M].北京:高等教育出版社,19CNMHG(下转第331页)第3期蔡建国等:湿式催化氧化技术的研究进展33Ipaper and pulp industrial waste liquor[J] Applied Catalysis A: General, 2002, 236: 255-262[28] PINTAR A, BESSON M, GALLEZOT P Catalytic wet air oxidation of kraft bleach plant effluents in a trickle-bed reactor overa Ru/TiO catalyst[ J] Applied Catalyssi B: Environmental, 2001,31:275-290[29]DAEWON P, WONSEOK C Decoloring dye wastewater with low temperature catalytic oxidation[ J]. Wat Sci Tech, 1999,40(4/5):115-121[30] LEI L, HU X, CHU HP, et al. Catalytic wet oxidation of dyeing and printing wastewater[J]. Wat Sci Tech, 1997,35(4):311[31] FAJERWERG K, FOUSSARD J N, PERRARD A, et al. Wet oxidation of phenol by hydrogen peroxide: the key role of ph onthe catalytic behaviour of Fe-ZSM-5[J]. Wat Sci Tech, 1997, 35(4):103-110[32] TUNG LI HUANG, JORDAN M MACLNNES, KEITH R CLIFFE, et al. Nitrogen removal from wastewater by a catalytic ox-ion method[J]. Wat Res, 2001, 35(9): 2113-2120[33] OXANA P PESTUNOVA, GALINA L ELIZAROVA, ZINFER R ISMAQILOV, et al. Detoxication of water containing 1, 1dimethylhydrazine by catalytic oxidation with dioxygen and hydrogen peroxide over Cu-and Fe-containing catalysts [J].Catalysis Today,2002,75:219-225Progress of Wet Catalytic Air Oxidation TechnologyCAl Jian-guo, LI Ai-min, ZHANG Quan-xingState Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, School of EnvironmentNanjing University, Nanjing 210093, China)Abstract: Wet catalytic air oxidation is a useful kind of advanced oxidation process for high strength, toxichazardous and non-biodegradable contaminants under milder conditions, which is developed on the basic of wetair oxidation. The basic concepts, mechanism and kinetics, classification and application to wastewater treatmentof wet catalytic air oxidation are reviewedKey words: wet catalytic air oxidation; wet air oxidation; catalyst; wastewater treatment(贵任编辑:梁俊红)上接第300页)Electroporation and PEG Methods of Transformationfor Methlyotrophic YeastLI Ya-dong, WANG Hui-wen, ZHAo Xiao-yuCollege of Life Sciences, Hebei University, Baoding 071002, China)Abstract: Electricporation and PEG transformation were used to transform methylotrophic yeast respectivelyThe transforming rate(DNA)of electroporation method was 400 transformants/ug, while the PEG methodwas only 0-20 transformants /ugKey words: methylotrophic yeast; transformation; eletroporation: PEC中国煤化产任编辑:梁俊红)CNMHG