乙醇对大鼠脑内5-HT能神经体系的影响

第40卷第3期解剖学报Vol 40, No. 3200年6月ACTA ANATOMICA SINICAJun.2009·395乙醇对大鼠脑内5HT能神经体系的影响李双成12康云霄!石葛明1“崔慧先2王磊2李学平(1.河北医科大学神经生物学研究室;2.河北医科大学解剖学教研室,石家庄050017[摘要]目的观察乙醇处理大鼠脑内色氨酸羟化酶(TPH)、5羟色胺(5Hr)和5羟色胺转运体(sERT)的表达改变判断乙醇对脑内5HT能神经体系的影响。方法以20%乙醇代替饮水饲养30只Wisr大鼠6个月;利用免疫组织化学、免疫印迹及流式细胞术等方法,分析乙醇处理大鼠有关脑区5HT能神经体系相关指标的改变。结果1.免疫组织化学法可见,乙醇处理组大鼠脑内中缝背核TH5H免疫反应阳性神经元数量少于对照组(P<00);TH免疫阳性神经元直径小于对照组(P<001);相关脑区TPH5-H和SERT免疫反应灰度值比对照组增高(P<0.05)。2.流式细胞术检测可见,乙醇处理组大鼠TPH、5HT和SERT的表达量低于对照组(P<0.05)。免疫印迹法检测可见乙醇处理组大鼠SERT和TPH与actn相对吸光度比值均小于相应对照组(P<0.05)。结论乙醇降低脑内TP5-HT和SERT的表达,可能改变脑内5HT能神经体系的功能活动[关键词]乙醇;色氨酸羟化酶;5羟色胺;5-羟色胺转运体;免疫组织化学;流式细胞术;免疫印迹法;大鼠[中图分类号]Q952.4[文献标志码]A[Do10.3969/j,in,05291356.2009.03.010Effect of ethanol on the serotonergic systems in rat brainL Shuang-cheng",Kang Yun-xiao, SHI Ge-ming", CUI Hui-xian, WANG Lei, LI Xue-ping(I. Department of Neurobiology: 2. Department of Anatomy Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China)[Abstract] Objective To study the effect of ethonal on the serotonergic systems by analyzing the altered expression oftryptophan hydroxylase(TPH), serotonin(5-HT)and serotonin transporter( SERT)in the brain of ethanol-treated rats. MethodsWistar rats were treated with 20% ethanol for 6 months. Immunocytochemistry, flow cytometry and Westem blotting were usedto analyze the altered expression of the serotonergic markers in different brain regions of the ethanol-treated rats. Resultsmistry showed the number of TPH or 5-Ht positive neurons in dorsal raphe nucleus( DRN)is leas in ethanol.treated rats than that in control(P<0.01), the diameter of TPHin dRN is smaller than that in control(P<0.01)andthe mean gray value of tpH, 5-ht and SERT in observed regions of the ethanol-treated rats is larger than that in control (P<0.05).2. Flow cytometry showed the expression of TPH, 5-HT and SERT in the studied regions of the ethanol-treated ratsdecreased significantly compared with control(P<0.05).3. Westem blotting showed the ratio of SERT/B-actinin or TPH/B-actinin in analyzed regions of the ethanol-treated rats is smaller than that in control(P <0.05). Conclusion Ethanol decreasesthe expression of TPH, 5-HT and SERT of rat brain, which may result in the altered activity of serotonergic systemsKey words] Ethanol; Tryptophan hydroxylase; Serotonin; Serottometry; Western blotting: Rat近年有关酗酒对脑内5-羟色胺(5T)能神经基有关。为进一步确定酗酒对脑内5HT能神经体系影响的研究主要集中于观察脑内5羟色胺转运体系的影响本研究利用免疫组织化学法、免疫印迹体( serotonin transporter,sERT)结合信号的改变“,法以及流式细胞术等观察乙醇处理大鼠有关脑区5但所获结果并不一致。表现为降低36无变H能神经体系的不同指标、特别是SERT蛋白的改化甚至增高,这很可能与所观察的酗酒个体例变,从而判断乙醇对脑内5H能神经体系的影响。数少、酗酒并发症各异以及缺乏SET特异性配材料和方法[收稿日期]2008-01403[修回日期]2003031.动物模型基金项目]河北省教育厅计划攻关项目资助(2007129);河北60只(河北医省科学技术研究与发展指导课题资助项目科大H中国煤化为对照组和乙醇作者蔺介]李双成(1971-),男(汉族),河北省石家庄市人,处理CNMHG大鼠参照More医学博士,副教授等的方法每天以20%乙醇代替饮水,每只实验动物通讯作者( To whom correspondence should be addressed)每日饮入20%乙醇量为(1642±1.35)ml。饲养6E-mail:shigml23@126.comTel:(0311)86265503个月后处死。396解剖学报40卷,3期2.实验方法隆抗体(1:500),4℃过夜。PVDF膜以TTBs洗32.1免疫组织化学染色:大鼠于深麻醉下次,每次10min。洗膜后加HRP标记的羊抗兔或小40g/L多聚甲醛(4℃)经心灌注固定h,取脑置相同鼠g(1:500037℃孵育1.5h。TTBs洗膜(3次,固定液后固定4h,300gL蔗糖液4℃过夜。所需部10min/次),TBS洗膜1次。增强型化学发光试剂位行冠状位冷冻连续切片(厚40m),间断集片,PB(ECL)增强化学发光后入X线片暗盒曝光,显影洗片后行免疫组织化学反应。相关切片分别以小鼠定影。底片透扫,用 Lab Works45软件测量免疫印抗色氨酸羟化酶( try tophan hydroxylase,TPH)单克隆迹条带相对吸光度值,计算与内参免疫印迹条带相抗体(1:100,Sigm公司)、兔抗5-HT多克隆抗体对吸光度值的比值,进行分析。(尾壳核1:50、脑干1:800,sigm公司)兔抗2.4统计学方法:所得上述相关数据以均值±标SERT多克隆抗体(1:1000,1 mmunostar公司)4℃孵准差(x±s)表示,经方差齐性检验后发现,该资料育48h;依一抗种属以生物素化羊抗小鼠lgG(1:服从正态分布且方差齐行成组设计的t检验,P<500)或羊抗兔lgC(1:500)室温孵育切片2h,1:5000.05为差异具有统计学意义。HRP链霉卵白素室温孵育1h。每步间以TBs洗片DAB呈色、贴片、封片、观察。用100g/L正常羊血清结果代替一抗,相同步骤孵育,作为阴性对照免疫组织化学结果细胞计数:40倍物镜下,参照 James等的方法,般观察发现,乙醇处理组大鼠中缝背核(B7)按 Paxinos大鼠脑图谱,分别计数中缝背核(B7)lcm2TPH、5-HT以及SERT免疫反应强度比对照组减弱面积中TPH和5HT免疫反应阳性神经元数量。(图1A,1B,2A,2B,3A,3B)。TPH5HT免疫反应细胞直径:40倍物镜下,参考 James等的方法,选阳性细胞数量少于对照组(1A,1B,2A,2B);高倍取中缝背核胞核明显、无重叠的TPH阳性神经元,测镜下,乙醇处理组大鼠中缝背核、尾壳核、隔核以及量其最长径及最短径,取平均值作为细胞直径。扣带皮质SERT阳性纤维比对照组稀疏(3A,3B,灰度测量: HPIAS-1000图文系统分析乙醇处理4A,4B,5A,5B)。和对照组中缝背核(B7)(TPH5-HT和SERT)、尾细胞计数显示,与对照组相比,乙醇处理组中缝壳核(5H和SET)、隔核、扣带皮质(SERT)的5HT背核TPH、T免疫反应阳性神经元数量明显减能神经元有关指标的灰度值。TPH、5T和SERT少,减少程度分别达到3564%和35.33%(P<的表达强度与测得灰度值负相关。0.01,表1)。细胞直径测量显示,与对照组相比,乙2.2流式细胞术检测:大鼠快速断头取脑冰板醇处理组中缝背核背侧部和腹侧部TPH阳性神经上取所需脑组织,制备单细胞悬液并取1x10/m细元直径减小程度达569%、腹外侧部达861%(P胞,分别加入小鼠抗TPH单克隆抗体、兔抗SERT多<0.01,表1)克隆抗体及兔抗5-HT多克隆抗体各0.1ml(1:100灰度测量显示,与对照组相比,乙醇处理组各指室温孵育30min,人PBs1oml洗涤,离心弃上清,入标灰度值均有增高。其中TPH在中缝背核(B7)增异硫氢荧光素免疫球蛋白G(FmCG)及藻红素免高幅度达19.91%(P<0.05,表2);5H在中缝背疫球蛋白G(PE1c)0.1ml避光室温孵育30min,加核(B7)和尾壳核的灰度值分别增高了30.47%和入PBs1ml离心,弃上清,PBS0.1ml经500目铜10.05%(P<0.05,表2);SERT在中缝背核(B)、扣网过滤上机检测,对蛋白免疫荧光标记物测定时设带皮质尾壳核和隔核的增加也分别达到16.30%、一抗或二抗的本底对照和阴性对照。电脑记录,分0.45%、19.17%和357%(P<0.05,表2别计数乙醇处理组和对照组TPH、5-H和SERT的2.流式细胞术检测表达量 X-mode值,所得结果转变成线性数据,取log乙醇处理组TPH、5-HT和SERT的表达量与对( X-mode)×340。照组相比减少,比各自相应的对照组分别减少了23免疫印迹法检测:大鼠快速断头取脑,冰板68%、13.88%和73%(P<0.05,表3,图6)。上取上下丘脑之间的脑组织入液氮速冻后入低温冰3.免疫印迹检测箱备用。取所需脑组织入4℃裂解液匀浆5min,冰中国煤化工与Bm免疫浴静置1h,4℃离心,取上清, Bradford法测定蛋白浓印带皮质、尾壳核和中度。每个样品取50总蛋白经100g/ L SDS-PAGE缝CNMHG76%(P<005,表凝胶电泳分离,电转移至硝酸纤维素(PVDF)膜上,4,图7);而中缝背核的TPH与 B-actin条带相对吸光用50g/L脱脂奶粉室温封闭2h,分别入50g/L脱脂度比值则减少了141%(P<005,表4图8)奶粉稀释的小鼠TPH单克隆抗体和兔抗SERT多克Vol, 40, No. 3李双成等.乙醇对大鼠脑内5H能神经体系的影响397图1A免疫组织化学法示对照组大鼠中缝背核TPH免疫反应。ABC法染色,DAB显色(下同)x16图1B免疫组织化学法示乙醇处理组大鼠中缝背核TPH免疫反应。x16图2A免疫组织化学法示对照组大鼠中缝图2B免疫组织化学法示乙醇处理组大鼠1A1B中缝背核5HT免疫反应。x图3A免疫组织化学法示对照组大鼠中缝背核SERT免疫反应。x13.2图3B免疫组织化学法示乙醇处理组大鼠中缝背核SERT免疫反应图4A免疫组织化学法示对照组大鼠尾壳核SERT免疫反应2A2B图4B免疫组织化学法示乙醇处理组大鼠尾壳核SERT免疫反应。x50图5A免疫组织化学法示对照组大鼠隔核sERT免疫反应图5B免疫组织化学法示乙醇处理组大鼠隔核SERT免疫反应ABC. DAB3A3B Fig 1B TPH immunoreactivity in the drn ofFig- 2A 5-HT immunoreactivity in the dRn ofcontrol group using the method ofFig2B 5HTeactivity in the drn ofethanol treated group using the method4Bof ABC. DABFig 3A SERT imrctivity in the DRN ofcontrol group using the methodABC. DAB staFig 3B SERT immunoreactivity in the drn ofethanol treated group using the meFig 4A SERT immunoreactivity in theCaudate-Putamen CPu)of control5A5Bgroup using the method of ABC. DABFig 4B SERT immunoreactivity in the CPu of ethanol treated group using the method ofFig 5A SERT immunoreactivity in the septal nucleus of control group using the method of ABC. DAB stain x50Fig5B SERT immunoreactivity in the septal nucleus of ethanol treated group using the method of ABC. DAB stain x50表1乙醇处理大鼠脑内5H能神经元的变化(均值±标准差)Table 1 The changes of of 5-HT energic neurons in ethanol-treated group(i+ s)5羟色胺(5-HT)色氨酸羟化酶(TPH)分组数目(个cm2)( number)数目(个/cm2)( number)直径( diameter,pm)中缝背核(DRN)中缝背核(DRN中国煤化工腹外侧部(Dv对照组( control24.57:0.7024.86±1.28乙醇处理组( ethanol)CNMHG 11.84+1.5015.89±0.6716.00±1.0010.82±1,69与对照组比较( Compared with control group)P<0.01398解学报40卷,3期表2乙醇处理组大鼠脑内相关脑区TPH5H和SERT的灰度比较(均值±标准差)Table 2 The comparison of the mean gray scale value of TPH, 5-HT and SERT in ethanol-treated group(i t s)色氨酸羟化酶TPH5羟色胺5HT5羟色胺转运体SERT分组中背缝核尾壳核中缝背核尾壳核中背缝核扣带皮质DRN8880±1.29164.94±1.844578±543102.68±7.72109.57±280149.44±14.16118.16±8.13乙醇处理组( ethano)106.48±681.52±2.4549.73±1.67122.36±754·120.45±665·180.00±1.85·157.83±9.46与对照组比较( Compared with control group)“P<0.01;P<0.05表3流式细胞术检测大鼠中缝背核TH5HT和SERT的表达变化(均值±标准差)Table 3 The altered expression of TPH, 5-HT and SERT in DRN of rat by flow cytometry(i t s)分组(goup)色氨酸羟化酶(TPH)5羟色胺(5-HT)5羟色胺转运体(SERT)对照组( contro)638.30±1.37439.2±19.99553.36±1513乙醇处理组( ethanol)595,20±13.5378.25±6,84513.11±12.05与对照组比较( Compared with control group)“P<0.05函10101021010°101021010°10102103FL2 LOGFL2 LOG相对含量( relative contaet相对含量( relative contaet相对含量( relative contrnet)1010101010°1010210≤10°1010210FL2 LOGFLI LOGFL2 LOG相对含量( relative contract)相对含量( relative contaet)相对含量( relative contaet)5-羟色胺(5-H色氨酸羟化酶(TPHD5-羟色胺转运体(SERT)图6流式细胞术检测乙醇处理组大鼠中缝背核5 HT. TPH和SERT的表达变化Fig.6 The expression of 5-Hr, TPH and SERT in DRN o brain rat by flow cytometry表4免疫印迹法检测乙醇处理大鼠脑内SERT和TPH的表达变化(比值均值±标准差)Table 4 The altered expression of SERT and TPH in ethanol-treated group(Ratio, i t s)分组色氨酸羟化酶(TPH)5羟色胺转运体(SERT)中缝背核(DRN)中缝背核(DRN尾壳核(cPu)扣带皮质(对照组( control)00064±1.13×10-4037:1.310-30.004:8.97×10-0.034±5.6乙醇处理组( ethanol0.0055±6.17X100.0034±1.53×10*0.002:1.35×100031:6.9×10与对照组比较( Compared with control group)“P<0.01ContreEthanol中国煤化工NMHG图7免疫印迹检测乙醇对大鼠扣带皮质、尾壳核和中缝背核SERT表达的影响d ehanol on SERtin Cingulate gyrus(Cg), CPu andVol 40, No. 3李双成等乙醇对大鼠脑内5H能神经体系的影响399进一步的研究证实。Control以往的研究表明脑内5H能上行投射纤维主要来自脑干中缝核群头侧组,其中中缝背核是最重要的5H能神经核团,与前脑如大脑皮质海马等诸多脑区具有广泛的投射联系。5-H受体具有多图8免疫印迹法检测乙醇处理对大鼠中缝背核TPH种亚型,参与脑内多种神经活动,如情感、认知及睡表达的影响眠等的调控。酗酒者6或酗酒人脑标本3sERTFig. 8 The effect of Ethanol on TPin drn of结合信号的减弱,以及我们在长期摄入乙醇大鼠脑内所发现的5H能神经体系多个指标降低,表明长讨论期摄入乙醇导致了5HT能神经体系功能活动的障碍,从而可能影响脑内5HT能神经体系所参与的功限速酶TPH决定神经递质5I的合成效率,位能活动。于5HT能神经末梢的膜蛋白SERT则通过再摄取突近年对酗酒者脑内是否存在5HT神经体系改触间隙的5H而中止其对突触后神经元的作用。变的研究主要以配基放射自显影术检测酗酒人脑标SERT既是反应5H能神经元功能活动的重要指本、以 CIT PET/SPECT配基显像技术检测酗酒者脑标,也是反应5H能神经末梢多寡的敏感指内的SERT结合信号变化,这些研究由于检测的只标。SET和TPH的表达变化都将直接影响5H是单一指标的改变,而SET蛋白表达受多种因素能神经元参与的神经活动。本研究通过对大鼠5HT的影响除与个体的遗传背景有关外“m,死后取材能神经元的免疫组织化学、免疫印迹以及流式细胞术的时间以及伴发疾病都可能影响SERT表达变化;结果的分析发现,乙醇处理引起脑内5HT能神经体另外,配基显像技术所用配基PCr,并非只结合系多个指标的降低。我们发现,无论是5-Ⅲ能神经SERT,有研究发现,βCT除结合SERT还能结合多元投射源区(中缝背核B7),还是其投射靶区(尾壳巴胺转运体( dopamine transporter,DAT)",而多数脑核扣带皮质及隔核)SET的表达均显著减弱。这与区都有SERT和DAT的交织分布,因此,应用pcr近年应用配基放射自显影技术发现酗酒人脑标本杏配基显像技术难以确定SERT在酗酒者脑内的真实仁核和尾状核SET结合信号减少-,应用配基显水平。同时酌酒还可能引起DAT的表达改变而混像技术发现酗酒者SERT标记信号显著降低以及淆SERT变化的真实本质,这些都可能是造成目前免疫放射自显影发现SERT表达减少的结果一研究报道结果不完全一致的原因。本研究采用致。SERT在所观察脑区的低标记信号的结果表明,SERT特异性抗体识别抗原的方法,检测的是组织内长期摄入乙醇可能干扰了5H能神经元的代谢活蛋白的含量高低,真实地反映了脑内SERT含量的动降低了SERT蛋白的表达。我们应用免疫组织化改变,并从多个方面观察到脑内5H能神经体系的学免疫印迹以及流式细胞术在乙醇处理组大鼠5-变化,为酗酒引起脑内5H能神经活动的障碍提供HT能神经元投射源区所观察到的TPH低表达以及其了直接的形态学依据反应产物5H在中缝背核、尾壳核降低的结果更进参考文献步说明长期摄人乙醇可能导致5HT能神经体系【1Mmr,mphE,HB,A. Serotonin transporter distribution功能活动的减弱。本研究在乙醇处理大鼠所观察到o alcoholic and nonalcoholic的SET、TPH以及5H的减少推测可能是乙醇处理companion糾lct: a whole-hemisphere autoradiog-y时[刀的毒性作用引起了大鼠脑内5-HT能神经元的变性所Am J Psychiatry,2002,159(4):599606,致。近年的研究发现长期乙醇处理可引起小脑普肯2】sokM, Thienen J, Haukijavi T,l. Amygdala Serotonin耶细胞树突内滑面内质网扩张,且部分这样的树突出Transporters in alcoholics measured by wholehemisphere autoradiography刀]. Synapse,200,61(8现衰老和缺氧过程中常见的变性体( degenerating【3 STorvik M, Tiihonen J, Haukijavi T,l. Lower serotonin transporterbodie)y,这些改变可能与神经元的内在特性有关同样的动物模型小脑颗粒细胞则无类似的超微结[4] Brown aK,CDr, Fujita M, et al.rr["c] DASB imaging构变化。尽管在普肯耶细胞未发现其他显著的超微中国煤化工=[.AcmP结构变化,但树突内变性体的存在至少提示这些[5]HCNMH神经元的功能受到一定的损伤,只是损伤程度可能较transporters in alcoholism[J]. Am J Psychiatry, 1998, 155(11):1544轻而未累及到神经元胞体。长期乙醇处理是否引起5HT能神经元相似的病理改变及损伤机制尚有待于[6】 Heinz A,JmpWG, et al. Relationship between cortisol解剖学报40卷,3期nd serotonin metabolites and transporter in alcoholism [ J]2005,20(20):1153-1155Pharmacopsychiatry, 2002, 35(4): 127-134李双成,石雄,石葛明,等,附酒与扣带回前部滕周皮质5羟色[7 I Starvik M, Tihonen J, Haukijarvi T, e al. Nucleus accumbens胺转运体的表达[J.临床荟萃,200,20(20):1153155serotonin transporters in alcoholics meaaured by whole-hemiaphere [13]Shi GM, Li ShCh. Cui HX, e al. Expression of serotonin transporter inautoradiography[J].Alcohol, 2006, 40(3):177-184.rostral raphe nuclei of brainstem in aleo holiehuman[J]. Chinese Joumal[8 OKada T, Fujita M, Shimada S, et al. Assessment of affinities o B-of Anatomy,2006,29(2):213215-219CIT, B-CIT-FE, and B-crr-FP for monoamine transporters permanently石葛明,李双成,崔慧先,等.5羟色胺转运体在酒人脑干头ssed in cell lines[ J]. Nucl Med Biol, 1997. 25(1): 53-58侧中缝核群的表达[].解剖学杂志,2006,29(2):213-215-219[9 ]Miner L, Schroeter S, Blakely RD, et al. Ultrastructural localization o [14 ]Dlugos CA. Ethanol-related smooth endoplasmic reticulum dilation inthe serotonin transparter in superficial and deep layen of the rotpurkinje dendrites of aging at[J]. Alcohol Clin Exp Ree, 2006,30terminals [J]. J Comp Neurol, 2000, 427 (2):220-234[15]Chen S, Hillman DE. Dying-back of Purkinje cell dendrites with[1o]Hariri AR, Holmes A.Gof emotional regulation: the role of theynapse Low in aging ms[J]. J Neurocytol, 1999, 28(3):187-196serotonin transporter in neural function[J]. Trends Cogn Sci, 2006, 10 [16]Heinz A, Coldman D, allinat J, et al. Pharmacogenetic insights to4):182-191monoaminergic dysfunction in alcohol dependence J][11] Nielsen K, Brask D, Knudsen GM, e al. Immunodetection of thePsychopharmacology(Ber), 2004, 174(4):561-570serotonin transporter protein is a more valid marker for serotonergic fibers [17] Heinz A, Jones DW, Mazzanti C, et a. A relationship betweenhan serotonin[JI. Synapse, 2006, 59(5):270-276serotonin transporter genotype and in tito protein expression and alcohal[12]Li ShCh, Shi X, Shi GM, et a. Expression of serotonin transporter inneurotoxicity[ I]. Biol Psychiatry, 2000, 47(7): 643-649pregenual anterior cingulate cortex of alcoholics[J]. Clinical Focus(编舞邹尚敏)《解剖学报》第十一届编委会主编章静波常务副主编周长满主编徐群渊李云庆于恩华许增禄顾晓松罗建红何大澄唐军民高福禄编委D. Brynmor Thomas Elaine F, Reed Stephen W. Carmichael Leonard L. Seelig JR安威柏树令蔡文琴常智杰陈东陈晓春陈耀星丁文龙窦犟华段相林方秀斌郭顺根韩代书韩卉何欣黄东阳姜宗来金国华金连弘景雅鞠躬李和李继承李金莲林建银刘斌刘佳刘树伟卢光琇罗学港马文丽穆祥牛建昭欧阳钩饶志仁桑建利宿宝責苏国辉唐茂林唐勇王海杰汪华侨王怀经王亚平吴燕婉王云川席焕久谢富康徐存拴徐慧君羊惠君姚大卫姚志彬应大君原林曾园山张传森张雷张志谦张钦宪张紹祥张世馥张卫光张远强赵玲辉周国民朱长庚邹仲之左伋左明雪(躺要以汉语拼音为序)中国煤化工CNMHG