聚乙二醇一步沉淀提取卵黄抗体

第29卷第5期福州大学学报(自然科学版)Vol. 29 No.5_2001 年10月Jourmal o[ Fuzhou University( Natural Science)Oct.2001文章编号:1000- 2243(2001)05 - 0123 -04聚乙二醇一步沉淀提取卵黄抗体王辉龙，周建武，王中来,饶平凡.(福州大学生物工程研究所,福建楣州350002)摘要:利用聚乙二醉一步沉淀法提取卵黄抗体.当聚乙二醇浓度为5%时，可获得66%抗体回收率,抗体纯度达92%;当聚乙二醇浓度为10%时，抗体纯度为85%，但可获得99%的抗体回收率，且抗体活性没有损失.关键词:卵黄抗体;聚乙二醇;沉淀;提取中图分类号: TQ936.2文献标识码: A经抗原免疫的母鸡能将体内的抗体传递到鸡蛋的卵黄中，从卵黄中提取的抗体称为卵黄抗体(IgY).IgY与哺乳类动物血清中分离的抗体相比具有许多突出的优点.如来源广、费用低、作为免疫检测试剂时，不会激活补体1、不会与类风湿因子结合[2]等.近年来，在卵黄抗体的纯化方面已进行了大量的研究[3-8),通常是在制备水溶性蛋白组分后,采用多次沉淀初步分离抗体,再应用各种色谱进行纯化.这些方法在获得IgY纯度和活性方面有其优点,但是包括了很多耗费时间的步骤，如多次盐析,乙醇沉淀，凝胶过滤，色谱和渗析等,不易规模化生产，本文报道了-种简单的提取卵黄抗体的方法.在制备水溶性蛋白组分后，用低浓度聚乙二醇(PEG)一步沉淀提取卵黄抗体,在不经色谱分离的情况下取得满意的纯度和活性.1材料与方法1.1 试剂与材料嗜水气单胞菌株(福建省农科院生物中心); PEG(分子量为6000,华美生物工程公司);碱性磷酸酶标记的抗IgY二抗(兔抗鸡二抗, Sigma); 磷酸对硝基苯酯二钠(0364 - 5G, AMRESCO); 翅滤膜(SMB -20型，中科院上海原子核研究中心); TSK G3000SW(TOSOH corporation).1.2抗原的制备保存的嘈水气单胞菌株经活化后接入普通培养基，在37C下培养48h,离心(10 000 r/min, 4C，3min)收集菌体，经生理盐水洗许3次后,用0.5%甲醛灭活过夜，经洗涤后，用生理盐水调节菌体依度为1X 109 efu/ mL.1.3免疫将包含1x 109 cfu/mL的菌液与等体积的完全福氏佐剂充分混合形成油包水体系，四点注射法对母鸡进行初次免疫，每次1mL.2周后，以不完全福氏佐试剂代替完全福氏佐试剂进行二次免疫,每周1次，持续3周. ELISA检测特异性卵黄抗体的效价.初次免疫后开始收集鸡蛋, 4七保存备用.1.4 水溶性蛋白组分的制备将免疫后的鸡蛋蛋赞液用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(0. 04 mol/L, pH6.0)稀释10倍[9], 4乜下静置过夜，沉降后的上清液加助滤剂经0.22 pm膜上过滤，滤液经截留分子量为70 000的超滤膜超滤脱盐浓缩8倍制备成水溶性蛋白组分(WSF).最后添加0.02%的迭氮钠于4个下保存.1.5 卵黄抗体的分离纯化S mL WSF中,加入4%至10%不同浓度的PEG,完全混合溶解后在4七下静置30 min,然后在4七下，用10000 r/ min转速离心6 min,收集沉淀，溶解于5 mL的蒸馏水中,用于随后的分析.收稿日期: 2001 -03-21作者简介:王辉龙(1976-),男，硕士.中国煤化工MHCNMH G福州大学学报(自然科学版)第29卷1.5.1抗体回收率及纯度分析样品用高压液相色谱法进行分析，色谱柱是TSK G3000SW,在室温下，流动相为含0. 1 mol/L硫酸钠的磷酸盐绶冲液(0.1 mo/L, pH7.0), 流速为0.5 mL/min,检测波长为280 nm.抗体的回收率和纯度分别按照下面公式计算:R抗体= (A抗体/Awsr) x 100%P抗体= (A抗体/A总崃) x 100%其中: R抗体是抗体的回收率(%), A抗体是纯化后样品的抗体峰面积, Awsp是水溶性蛋白组分中抗体的蜂面积，P抗体 是抗体的纯度, A总峰是纯化后样品中所有峰的总面积.1.5.2特异性抗体 ELISA的检测特异性抗体活性的检测参照Cost10]的方法进行.1.5.3 SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白的SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳分析是参照Leammli方法[1]进行, 4%的浓缩胶, 7. 5%的分离胶,电泳恒压150V,电泳样品用G250考马斯亮蓝染色后再按照标准程序褪色.2结果与讨论2.1卵黄抗体 的高压液相色谱法分析表1列出了不同浓度的PEG沉淀WSF所获表1 PEG 浓度对卵黄抗体回收率和纯度的影响得的抗体回收率和纯度.随着PEG浓度的提高，wrec/ %A扰体R抗休/%P抗体/%抗体的回收率也提高，但纯度随之下降;聚乙二268 (Aws)醇浓度为5%沉淀时，可获得66%抗体回收率,114189抗体纯度达92%(图1和图2);当聚乙二醇浓度17756)2为10%时，抗体纯度为85%，但可获得99%的19774抗体回收率.这是由于PEG的加入，产生空间位阻效应[12),促使蛋白积聚沉淀，而且蛋白的分子2077790量越大越被PEG沉淀[13];抗体的分子量大，因227858此，在低浓度PEG的时候，抗体首先被沉淀,当257)686PEG浓度升高时，抗体沉淀量增大,但同时低分1026599子量的杂蛋白的沉淀量也加大,纯度也就下降.0.300 I0.300 tlg)0.2000.200 |0.1000.000w.0.0020.0035.0035.00 .1/min图1抗体样品(5%PEG沉淀)的HPLC色谱图图2 WSF 的HPLC色谱图中国煤化工MHCNMHG第S期土辉龙等:聚乙二醇一步沉淀捉取卵黄抗体125。2.2特异性抗体 的检测图3是符异性抗体活性回收率的检测结果.为了便于比0.8较，WSF和PEG提取的抗体样品在ELISA检测时秘邦相同的倍数.虽然经PEG沉淀后抗体量有所损失,但足提纯后的0.6抗体去除了杂质的干扰ELISA值较高，这与相关文献报道相华 04符14.15].022.3 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析从图4可以看出，经PEG一步沉淀提取后。样品中的主WSF4s678.910要蛋白帶分子最为180 kD左在，这与相关文献报道相符(S].图5是WSF的电泳蛋白分布图。图6是WSF与用不同浓度的PEG沉淀WSF后的上清液的电泳图，当PEG的浓度达到图3不同浓度的PEG提收抗体的活性与10%时，上清溶液中无明显的抗体带.WSF中杭体活性比较4%5%6%7%。8%9%10%WSFWSF5% 6% 7% 8% 9% 10%IgY- 200kDgY- 130kD- 97.4kD- 66.2kD-43kD图4用不同浓度 PEG提收的抗图S WSF 与标准蛋白的图6 WSP 与用不同浓度PEG沉淀体的电泳图电泳图WSF后上情液的电状图3结语采用PEG一步沉淀法提取卵费抗体,能够获得较高的抗体回收率和纯度.用5%的PEG能够获得66%的抗体回收率，纯度达92%;用10%的PEG浓度时，纯度为85%，但是能够获得WSF中99%的抗体，并且该方法可以在不需要经过任何色谱分离的情况下，根据不同需要灵括应用，这在大规模制备卵黄抗体方面具有很大的应用价值.参考文献:[1] BenmnHN, Brufield HP. 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Theantibody recovery was close to 100% and the antibody purity was up to 85 % by employing 10% PEG withoutusing any chromatography, while the activity of IgY wasn' t afected by PEG.Keywords: egg yolk antibody; polyethylene glycol; precipitation; purification(接笫118页)The application of egg - yolk antibody on preventing and curing tryonyx sinensis diseaseCHEN Qiang', ZHOU Jian - wu', RAO Ping - fan', LIN Jin - zhong?(1. Institute of Biotechnology, Fuzhou University, Fuzbou, Fujian 3500020, China; 2. Institute of Fishery Science, Putian,Fujian 351100, China)Abstract: The article discusses the applcation of egg yolks specific antibody on preventing and curing tryonyxsinensis disease. Immunized chicken produced high titer egg - yolk antibody in the eggs. Lyophilization haslittle effect on the activity of antibody. It was shown by invitro bacteriostatic experiment that egg yolk specificantibody had high inhibitory activity on the growth of Aeromonas hydrophila. Passive immunizationexperiment demonstrated that the secific antibody exhibited satisfactory effects on tryonyx sinensis disease.Keywords: tryonyx sinensis; aeromonas hydrophila; eggs yolk antibody; passive immunization中国煤化工MYHCNMHG