聚乙二醇活性酯对干扰素α2b化学修饰的初步研究

●210●中国生物制品学杂志2001年第14卷第4期Chnin J Bidogpcie 2001,0 V01.14.No.4聚乙二醇活性酯对干扰素azn化学修饰的初步研究刘丽军赵丽纯朱迅(吉林大学 ,长春130021)石晓丽刘丹张岩张雪梅盛军(长春生物制品研究所,长春130062)[摘夔]目的探讨聚乙二醇活性酯(mPEC - ss MW 5000和MW 2000)0饰重组人干扰索啦(hIFN a )的最佳反应条件。方法在不同反应条件下 ,用聚乙二醇活性酯修饰dlENar采用VsV - Wish细胞病变抑制法测定修饰后thIFNas的生物学活性。结果随着PEG对dhIFNias 摩尔比的增加或修饰反应时间的延长,tJFNou的修饰产物相对分子质量和不均一-性增 加，且随着rhlFNos修饰度的提高,其生物学活性逐断降低。结论初步确立了 PEC修饰thIFNcr的反应条件,反应摩尔比与聚乙二醇活性酯的相对分子质量是影响反应的关键因素。{关键词]聚乙二醇活性酯 tuFNos, 化学修饰Chemical Modification of rhUFNaxo with Activated Polyethylene GlycolLU Lijun,ZHAO Lichun,ZHU Xun et al( Basic Medical School of Jilin Uniersity , Changchun 130021)[Abstract] Objective To explore the oplimal condition of modifing thlFNas by activaled polyetbyleneelycol with relative molecular 0q9999qq9 wexjights of 500 and 2000. Methods thIFTNas was modified withactivated plyehylene gyol under various conditins, and the bioactivity of the modifiedl IFNaxs was analyed byVSV- Wish system. Results Along with the increase of the ratio of PEC to hIFNash as well as he reactiontime. ,the relative molecular weight and inongneity of the nodified thIFN咖were also incrxsed. And the bio-activity of PEG - hIFN QB was reduced with the improvement of modification degree. Conclusion The optimalcondition of modifying hIFN咖with ativated plyethylenc g!ycol is prelininaily determined. The molar ratio ofPEG to hIFN and the relative molecular weight of PEG play important rules in he modifcation.[ Key words ] Activated polyethylene glycol hlFNax Chemical mdification干扰素([FN)是由细胞分泌的一类诱生性蛋白为991029- 5,由长春生物制品研究所提供;质,具有广谱的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能"',1.2 PEC活性酯( MW5000和MW20000)购自是目前公认的最为有效的抗病毒药物之一。目前全Signa 公司;球有60多个国家和地区应用干扰索制剂治疗大约1.3 CM - Sepharose F为Phamnacia公司产品;30多种疾病,取得了良好的治疗效果。但长期使用1.4Wish细胞及VSV病毒由长春生物制品研IFN易产生抗体,且因其相对分子质量小,在体内易究所提供。经肾小球滤过排泄,导致其半衰期短,影响疗效。利2.方法用一些无毒H水溶性好的免疫惰性大分子聚合物2.1 rhlIFNcqp 和PEG( MW5000)投料摩尔比对修(如PEG等)对其进行化学修饰可改变其相对分子饰产物的影响:二者的摩尔比分别为1:5、1:10.1:15质量及免疫原性,从而使修饰蛋白在循环中半衰期和1:30反应2h后,0.5%冰醋酸终止反应,取样作明显延长2。本研究采用PEC活性酯修饰SDS - PACE,并测定其生物学活性。h[FNay ,并对不同修饰条件下得到修饰产物的相对2.2 rhIFNa 和PEC( MW5000)反应时间对修饰分子质量和生物学活性进行研究,以便选择最佳修产物的影响:于hIFNas溶液中按1:10摩尔比加入饰条件.提高thIFNa>b 的药效作用。PEC(MW5000) ,反应时间分别为1.2和4h,取样作材料与方法中国煤化工个影响:于hIFNas溶1.材料w5000),反应pH分1.1 IFNap半成品,效价为Ix 10IU/ml,批号:fYHCN M H G 2h，,取样作SDS-中国生物制品学杂志2001年第14卷第4期Chin J Ridogcule 2001. Vol.14.No.4●211●PAGE,并测定其生物学活性。2.在pH8.5-9.5范围内.PEC与hlFNas的摩2.4 PEG 相对分子质量对修饰产物的影响:选尔比为10:1时,反应产物无显著变化.均主要显示择pH9.0. PEC( MW5000)和PEG( MW20000)分别与相对分子质量29000和19000两条带。在pH8. 5.9.hIFNa,反应2h终止,取样作SDS-PAGE,并测定其0和9.5反应时间为2h时.其中相对分子质量29000生物学活性。.的修饰蛋白分别占总蛋白的30%、33%和30%。表2.5 PEC - FNar的分离纯化:以CM - Sepha-明当溶液在pH8.5-9.5的范围内,在其他反应条件rose FF为层析介质,20mmol/L NaAc - HAc (pH5.0)一致时,其反应产物差异无显著意义。为洗脱液,柱层析法纯化反应产物。3.在plH9.0,PEC与rhlFTNasn投料摩尔比为10:12.6生物学活性测定;采用细胞病变抑制法时,不同时间取样,经SDS-PAGE检测,反应至2h(CPE)2] ,以Wish - VSV为基本检测系统,用国家参时,相对分子质量29000 的修饰蛋白占总蛋白含量考晶校准为IU,应为其标示量的75% ~ 150%。达最高(33%),再增加时间弥漫带明显增加.见图2.7蛋白含量测定:按2000年版《中国生物制2。品规程>中微量法(Lowy)的要求进行。M结果97 00066 0001.随着PEG(MS000)对thIFNap投料摩尔比的43 000增加,修饰产物的相对分子质量和不均一性增加。经34 700SDS - PAGE测定,未经PEG修饰的rhIFNc2r显示两条21 000带,相对分子质量分别为19000和380(为thlFNan的14 400二聚体,含量<5%),当反应时间为2h, PEC与hIFNag摩尔比为5:1时,反应混合物主要示有相对分子质量29000和19000两条带和一-些相对分子质量大图2 PHG与rhIFNm不同反应时间的修饰产物sIs- PAGE的弥漫带,其中相对分子质量29000的为修饰蛋白，Fig 2.SDS - PAGE profle of rhIFN始modifed by PEG占总蛋白的19%。当二者摩尔比为10:1 时,反应混at diferent reaction time合物亦主要示有相对分子质量29000和19000两条带5, rhlFNics ;4, standard protein marker; The reaction tine和一些相对分子质量大的弥漫带,但相对分子质量of lanes 3,2 and 1 are lh,2hand 4h respectrely.2900的修饰蛋白占总蛋白的33%。当二者摩尔比为15:1和30:1时,反应产物中大于相对分子质量290004.以PEC( MW5000)和PFC( MW20000)分别修的弥漫带明显增多,见图1。表明摩尔比是影响反应饰HIFNan ,得到以相对分子质量2900和60000为产物的一个重要因素。主的修饰蛋白,PEG(MW0000)修饰所得的相对分子质量6000蛋白占总蛋白的52% ,并且相对分子质量60000的修饰蛋白生物学活性高]相对分子质量29000修饰蛋白。5. PFEG( MW20000)与nhIFNarp 反应混合物经CM-Spharose纯化后得4个洗脱峰,峰1为术结合的PEC,峰2为过度修饰的产物,峰3为PEC - IFNaw(约MW0000) ,峰4为未经修饰的IFTNas,见图3。1234566.所得的修饰产物中IFN生物学活性随着修图1 PeG 与hNn不同你比的修饰产物SIS-PAGE饰后相对分子质量的增加而降低。修饰前hIFNasFig 1.SDS- PAGE prolGle of rhuIFN Crb mdified by DEG的比活性为1x 1o0*IU/ng,相对分子质母6000的修a dferentt molar ratios饰蛋白比活为1 x 10' IU/mg,相对分子质量29000的1,standard poteio marker;2, rhINa2.The molar ratios修饰中国煤化工of PEG to hIFNiam in the lanes 3,4,5 and 6 are 5:1,10:1,15:YHCNMHG1 and 30:1 respectively.212●中国生物制品学杂志2001年第14卷第4期(hin J Roioicels 201.0 Val .14.No.4对IFTNaz2投料摩尔比的增加,修饰蛋白的相对分子质量增加,hIFNaxb的修饰度亦增加，且修饰的不均一性也增加,但hIFNarb的生物学活性保留亦下降,这与Tsusumi等用PEG活性酯修饰TNFa时观察到的结果相似'5]。因此,从修饰所带来的rhlPNagn相对分子质量的增大程度和修饰后hIFNap生物学活性保留程度看,相对分子质量大的PEG优于相对分子质量小的PEG。据此,我们选用了PEG活性酯的相对分子质量为0000。1234在碱性条件下,偶联反应易于发生,即PEC的活性高;在酸性条件下,偶联反应终止。但在碱性条圈3修饰产物的纯化件下.随着pH的升高, PEG活性酯水解亦加快。本Fig 3. Purication of modification products文的修饰反应最终确定在pH9.0的硼酸盐缓冲液中进行,在该pH下，反应时间为2h时,单个PEC-讨论IFNg得率最高。同时, PEC活性酯与FNQs在碱性hIFNa2相对分子质量为1900, 属小分子蛋白，条件下反应时,虽然PEG是过量的,但易降解,因易经肾小球滤过,并易被血液中的胰蛋白酶等降解,此,延长反应时间对修饰反应影响不大。在相对分子质量15000 ~ 70000的范围内，肾脏清除日前,对修饰产物生物学功效的研究还在深入小分子蛋白质的速率与其相对分子质量大小呈负相进行,相关结果将另文发表。畚考文献应用线性的免疫惰性大分子PEC与蛋白质的非必需基团共价结合,其相对分子质量大大提高,不「1} lee V HL. Ppuide und prtein dng dererepcutrubcao exd cllage.Pharm In, 1986,8:208 -211.易被肾小球滤过。蛋白质经PEG修饰后,形成一种[2] Jeng sT. Byun SM, Deuresed aluiniuilit d nxtxy - plytbylare屏蔽,使它作为异源物质不被识别,不容易产生相应dyol atarhed rod blood clls: sgifcaute因a blod substitue Atirt抗体,抑制了相应的免疫反应,因而通过免疫反应被Cells Hlod Subtit lnxbsil Biocchmol. 196.24:503 -511.清除率亦降低,同时由于这种遮蔽作用使蛋白质不[3]中国生物制品规程(-部).1995,257.易被蛋白酶降解'。而且PEG无毒性,是FDA批准[4] Fonry RE. Chenical mdificarin of poiein: commenrs and persoc-fivs. Int Pep Protein Res, 1987 ,29:;145- 158.的可用于人体的聚合物，在体内不会进行生物降解[5] Tatsemni Y,Kihin S.Tunode Hea al Mcecalar Deign d Hsbrid Tu.产生有毒衍生物,相对分子质量小的( < 5000)PEGmor Necrois Factor - a Has Mekedly Fnhanoed Aniunor Potency due可由肾脏直接排出。因此,PEG化学修饰蛋白质具to Longer Pasanre Hulf- lie and Higher Tumort Auuiation. Phama有较高的应用价值。Exp Ther, 19.6278:10060- 1011.(收稿日期:2001-11- 12)研究表明,影响修饰反应的关键是反应摩尔比和PEG的相对分子质量。随着反应中PEG活性酯中国煤化工MYHCNMHG