以菊芋粉为原料同步糖化发酵生产燃料乙醇

第25卷第11期农业工程学报VoL 25 No 112009年1月Transactions of the csae以菊芋粉为原料同步糖化发酵生产燃料乙醇汪伦记12,董英江苏大学食品与生物工程学院,镇江212013:2.河南科技大学食品与生物工程学院,洛阳471003)摘要:利用粟酒裂殖酵母( Schizosaccharomyces pombe)能发酵菊芋未水解糖液高产乙醇的特点提出了以菊芋粉为原料,同步糖化发酵生产燃料乙醇的新工艺。在摇瓶中考察了原料预处理方法、原料浓度和初始pH值对乙醇发酵的影响,进而在5L发酵罐中考察了未调控pH值和恒定pH值与通气情况对乙醇发酵的影响结果表明:该菌株最适pH值为40100目筛分的菊芋粉发酵效果良好,115℃灭菌处理优于121℃,在此条件下,菊芋粉浓度200gL时,乙醇产量达到6658g/L,理论转化率为8588%:发酵液pH值下降对乙醇发酵没有影响,通入适量氧气会导致乙醉产量的下降,这表明粜酒裂殖酵母进行乙醇发酵时不需要供氧:通入氮气保持厌氧环境不能显著提高乙醇产量,不通气进行乙醇发酵也达到髙的转化率,因此在工业生产中,不必保持厌氧发酵环境。在此基础上,对菊芋粉补料发酵进行了试验,补料至菊芋粉终浓度为300g仉,发酵终点乙醇浓度为948g,理论转化率为8154%。这些研究工作,为以菊芋为原料的燃料乙醇工业化生产提供技术依据关键词:乙醇,发酵,生物质,同步糖化发酵,巢乘酒裂殖酵母,生物质能,菊茅doi:103969/issn.1002-68192009.11.048中图分类号:S2162文献标识码:A文章编号:1002-6819(2009-11-0263-06汪伦记,董英.以菊芋粉为原料同步糖化发酵生产燃料乙醇[J.农业工程学报,2009,25(11):263-268Wang Lunji, Dong Ying. Production of ethanol by simultaneous saccharification and fermentation from Jerusalem artichokeflour[J]. Transactions of the CSAE, 2009, 25(11 ): 263-268. (in Chinese with English abstract)0引言以菊芋为原料生产乙醇很早就受到人们的关注,近来重新受到国内外的重视,国外从20世纪50年代开面对石油资源的日益减少,不断加剧的能源危机和始发酵菊芋生产乙醇的研究,90年代进行了大量工造成的环境污染,以生物质为原料发酵生产燃料乙醇的作1,其工艺流程主要包括先将菊粉酸解或酶解,然后研究越来越受到各国的重视,成为世界各国重点研究和利用酵母或细菌等具有发酵能力的菌株进行发酵,或者推广的能源课题之一2。传统燃料乙醇主要由玉米生利用高产菊粉酶的微生物如黑曲莓( Aspergillus niger)或产,目前玉米乙醇、生物柴油等第一代液体生物燃料已脆壁克鲁维酵母( Kluyveromyces fragilis)与酿酒酵母经逐步应用于国际国内工农业生产,成为石油燃料的( Saccharomyces cerevisiae)混合发酵,但其菊粉酶分解个有力补充,然而由于玉米乙醇、生物柴油以粮食、油菊粉生成果糖与发酵果糖产乙醇仍分别由2种微生物完料种子为原料,须占用大量耕地,与国家粮食安全存在成,无法达到十分协调的同步糖化发酵。矛盾,中国已叫停粮食乙醇的开发,要求今后生物燃料粟酒裂殖酵母( Schizosaccharomyces pombe)最初由的发展必须满足不占用耕地、不消耗粮食和不破坏生态非洲人饮用的粟酒中分离得到,甘蔗糖蜜和水果上也能环境为前提找到。用菊芋(鬼子姜)制成的未水解糖液发酵能得到在这方面,菊芋具有独特的优势,菊芋适应性强,非常高产量的乙醇。本研究使用能利用菊粉且乙醇发酵特别适合在沙漠、滩涂、盐碱荒地等非农业耕地种植,性能优良的粟酒裂殖酵母,探讨了同步糖化发酵且产量髙,价格低廉。菊芋块茎菊粉含量丰富,占其干( simultaneous saccharification and fermentation)模式下,基质量的70%~90%。菊粉是果糖的聚合物,外切型菊用菊芋粉为原料生产燃料乙醇的工艺条件,为工业应用粉酶能分解菊粉成单个果糖,因此可以利用产外切菊粉提供依据。这是首次研究粟酒裂殖酵母发酵菊芋生产燃酶的微生物快速分解为果糖,再发酵生产乙醇。因此与料乙醇的报道。粮食类淀粉质原料相比具有优势,将是中国燃料乙醇产业规模化发展可选择的原料之1材料与方法稿日期:20090305修订日期:200905-31基金项日:镇江市农业攻关项目(NY2006043)中国煤化工作者简介:汪伦记(1972-),男,博士生,主要从事微生物与发酵工程的CNMHG中国工业微生物菌种研究,洛阳河南科技大学食品与生物工程学院,471003保藏管埋中心Emailswhunji@sohu.com※通信作者:董英(1954-),女,教授,博士生导师,主要从事食品功1.1.2菊芋粉能因子和食品生物技术的研究,镇江江苏大学食品与生物工程学院菊芋购自安徽滁州,鲜菊芋经洗净、切片、晾晒212013.Email:yoong@ujs.edu.cn烘干、粉碎后置干燥环境中保存备用。农业工程学报200年1.1.3培养基内径2mm。气化室、色谱柱及热导检测器的温度分别为1)斜面培养基:豆芽汁蔗糖琼脂培养基,接种一环150,120,150℃。菌种于豆芽汁蔗糖斜面培养基,30℃,培养72h,储于4℃理论转化率=冰箱备用Cx0.76x0.512)种子培养基(gL):菊粉20,酵母膏15,蛋白胨式中:Cg—乙醇浓度,gL;C—菊芋粉浓度,gL,pH46,12l℃灭菌20min076—菊芋粉中总糖含量(菊粉和还原糖含量之和)3)乙醇发酵培养基(gL):直接由菊芋粉配制.除0511—每g果糖转化为每g乙醇的换算系数。特别指出外,溶液中菊芋粉浓度为200gL。还原糖和总糖的检测:DNS法1;总糖测定以还原1.2试验方法糖计,定量待测样品于005 mol/L HCl中,沸水浴中回1.2.1种子液的制备流水解1h,用005 molL NaOH调成中性。S. pombe接种种子培养基后,在30℃条件下培养pH值的检测:pHS25B型数字酸度计。总氮:凯氏48h,细胞浓度达到1×105 cfu/mL以上。定氮法(GB5009-2003)。粗纤维:稀酸稀碱法1.2.2原料预处理方法的研究(GB50095-2003)1)原料粉碎度的影响菊芋粉碎后筛分出60~40目、100~60目、100目结果与分析以下3种粒度段的菊芋粉混合物,配制200g菊芋粉溶21菊芋粉的成分分析液,用HCl调节pH值至40,121℃灭菌20min,接种量对从安黴滁州购买的菊芋的组成成分进行了分析,5%,30℃培养48b,测其乙醇产量,确定最佳原料菊芋由表1可知,菊芋全粉中主要成分是糖类化合物,总糖粉颗粒大小的质量分数占8190%,可被粟酒裂殖酵母发酵的底物,2)原料灭菌温度的影响包括菊粉和还原糖,其质量分数占76%左右。因此,直配制200gL菊芋粉溶液,用HCl调节p值至4.0,接利用菊芋粉发酵产乙醇是可行的,此外,菊芋全粉中选择115℃和121℃分别灭菌35和20min,接种量5%,还含有一定量的蛋白质和灰分,不需添加氮源和无机盐,30℃培养48h,测其乙醇产量,确定最佳原料灭菌温度。可以降低乙醇发酵的成本1.2.3不同初始pH值对乙醇发酵的影响表1菊芋粉的组成成分配制200gL菊芋粉溶液,115℃灭菌35min,接种Table 1 Composition of Jerusalem artichoke flour量5%,30℃培养48h,初始pH值分别为3.5、40、4.5质量分数组成成分质量分数5.0、55,考察pH值对乙醇发酵的影响,确定最佳pH湿度%6.54粗纤维%值总糖/%1.2.4菊芋粉浓度对乙醇发酵的影响菊粉%灰分%446选择150、200、250和300g4种菊芋粉浓度,初还原糖%3.12其他%始pH4.0,115℃分别灭菌35min,接种量5%,30℃培养至乙醇发酵结束,测其乙醇产量,确定最佳原料浓度。22原料预处理对乙醇发酵的影响1.2.5pH值控制策略对乙醇发酵的影响2.2.1原料粉碎度对乙醉发酵的影响最佳pH值确定后,在5L发酵罐(镇江东方生物工原料粉碎有利于菊芋粉的溶解,同时也有利于酶对程有限公司)中研究乙醇发酵过程中pH值变化,末控和菊粉的分解和乙醇发酵。从表2中可知,菊芋粉的颗粒控制pH值恒定对乙醇发酵的影响。越细,乙醇浓度和理论转化率越高。用100目筛分的菊1.2.6通气量对发酵的影响芋粉发酵乙醇浓度为64.82gL,理论转化率达到8361%发酵罐中盛装2500mL200g/L菊芋粉发酵培养基高于60~40日和100~60目2个粒度段菊芋粉发酵的乙分别接入种子液10%。向发酵罐单位体积发酵液中通入醇浓度,这是由于原料颗粒越细,菊粉越易浸出和被利100mL/min氮气维持厌氧条件,不通入任何气体和通入用,同时溶液的流动性也很好;60~40目和100~60目100mL/min空气下进行批式发酵试验。初始pH4.0,温2个粒度段菊芋粉溶液,由于原料颗粒的吸水溶胀,导致度30℃,转遠200r加mi,考察不同通气条件对乙醇发酵溶液自由水减少,发酵液黏稠,流动性差,粟酒裂殖酵的影响。母与原料难以均匀接触,造成原料利用不完全,乙醇浓1.2.7菊竽粉补料发酵度只有5582gL和5981g几,理论转化率仅为72%和以100目筛分粗菊芋粉为底物进行补料发酵,pH中国煤化工值控制在40左右,温度30℃,转速200rmin,接种量H芟酵的影响CNMH为10%。配制起始菊芋粉浓度为200g/L,培养至24h和40h分别添加菊芋粉至浓度250和300g/L。菊芋粉粒度/目乙醉浓度(g·L)理论转化率%1.3分析方法乙醇浓度的测定:按文献12],HP4890D0气相色谱工100~>607716作站搞柿akQ粒度80~100目,长2m,外径3mmn,8361第11期汪伦记等:以菊芋粉为原料同步糖化发酵生产燃料乙醇2.2.2原料灭菌温度对乙醇发酵的影响菊芋粉溶液浓度可以选择200~250gL之间高温蒸汽灭菌会破坏原料中的营养成分,特别是含表4底物浓度对酒精发酵的影响糖量高的原料,易使糖类物质形成氨基糖、焦糖,而这 Table4 Effects of substrate concentration on ethanol fermentation些物质会影响微生物的生长,进而影响代谢产物的生成。菊芋粉浓度(g·L)醇浓度(gL)理论转化率%菊芋粉含糖量高达其干基质量的70%~90%,因此对菊芋5222粉溶液进行不同的高温蒸汽灭菌处理,研究其对乙醇发938039酵的影响。本文选择2种经常采用的高温蒸汽火菌方法:115℃灭菌35min和121℃灭菌20min进行试验发酵结束后,菊芋粉溶液经过12℃灭菌20min,乙醇浓度和理2.5pH值控制策略对乙醇发酵的影响论转化率分别为6367gL和82.13%,前115℃灭菌35min,在发酵过程中,随着菌体对营养物质的利用和代谢乙醇浓度和理论转化率分别达到65429L和8439%这产物的积累,发酵液的pH值必然会发生变化,粟酒裂殖表明,处理温度越高,对发酵液中的营养成分破坏越严酵母发酵菊芋粉生产燃料乙醇的过程中,在不同初始pH重。因此,生产中可采用较低的温度(11℃灭菌35min),值条件下,发酵结束后,pH值降低了0.5~08个单位同时也可以减少能源的消耗,降低生产成本从图1可以看出,在最适初始pH4.0发酵时,0~40h23不同初始pH值对乙醇发酵的影响发酵液pH值快速下降,40h后,发酵液pH值趋于平稳pH值是影响微生物生长代谢的关键因素之一。pH在pH值快速降低的过程中,同时伴随乙醇浓度的快速增值能够影响酶的活性,以及细胞膜的带电荷状况。细胞加(图2)。出现这种现象是由于粟酒裂殖酵母进入快速膜的带电荷状况如果发生变化,膜的透性也会改变,从增长和代谢活跃期对营养成分利用的结果而有可能影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的分一未调掉p值一·恒定pH值泌。由表3可知,粟酒裂殖酵母最适发酵初始pH值为4.0,乙醇浓度最高,达到6551gL。发酵结束后,发酵液的pH值都比初始pH值有不同幅度的下降高初始pH值发酵液易褐变,同时溶液变黏稠,流动性变差,乙醇浓度也随初始pH值的升高而下降,这可能是由于分解菊3.5粉的酶和发酵糖产乙醇的酶系受pH值升高而导致酶活下降的缘故发酵时间/h表3不同初始pH值对乙醇发酵的影响Table 3 Effects of initial pH value on ethanol fermentation图1未调控pH值和恒定pH值发酵时的pH值变化pH值乙醇浓度(g·L)发酵结束pH值Fig 1 Changes of pH value during batch culture under为研究发酵液的pH值变化对乙醇发酵的影响,在6l054035L发酵罐中进行了未调控pH值和恒定pH值的对比试57154出可知,理次前和知前发度为2.4原料浓度对乙醇发酵的影响到6612g几L和6580g/L,其原因是因为粟酒裂殖酵母在原料浓度对乙醇发酵有重要的影响。乙醇发酵是典pH35时,其酒精产量也比较高,达到6394g八L,在最型的产物抑制,在乙醇浓度达到4%左右时,就开始产适pH40进行乙醇发酵中,pH值下降幅度不大,对粟酒生抑制,发酵速度逐渐降低直至停止,因此原料浓度裂殖酵母的发酵活性没有影响,因此,在工业化生产中,过高会导致原料利用不完全,为尽量提高原料的利用率,可以不用控制pH值恒定常常采用较低的浓度进行乙醇发酵,但浓度的降低造成发酵结束后发酵液酒精含量低,增大了蒸馏的能耗。因60此,对不同浓度菊芋粉溶液进行了发酵产乙醇的试验对比不同浓度菊芋粉溶液的乙醇浓度和理论利用率,确定合适的发酵浓度。从表4可知,乙醇浓度随菊芋粉浓值度的增加而增加,但理论转化率却降低,300g菊芋粉中国煤化工一侧p值溶液乙醇浓度达到8954gL,而其理论转化率只有7687%;200gL和250g菊芋粉溶液其理论转化率分CNMHG别达到8488%和80.39%,乙醇浓度分别为66.58g/L和发酵时间/7793gL,基本能达到目前淀粉质原料的转化率:150g图2未调控p值和恒定pH值发酵时的乙醇浓度菊芋粉溶液发酵产乙醇虽然理论转化率达到89.78%,但Fig 2 Concentration of ethanol during batch culture under乙醇浓级据有524因此进行工业化生产时uncontrolled and constant ph conditions农业程学报009年2.6通气量对发酵的影响菊芋粉溶液400mL和480mL,分别使底物总浓度达到乙醇发酵是厌氧发酵,然而维持厌氧发酵环境会影250gL和300gL。试验结果如图4所示,乙醇浓度随发响酵母的生长繁殖,因为细胞快速增殖需要氧气,但向酵时间的延长快速增加,96h,其乙醇浓度达到最大,为发酵液持续通入氧气会导致发酵终点时乙醇浓度降9481gL。理论转化率达到8154%,高于分批发酵的低1,因此选择通入高纯氮气维持厌氧环境、不通气发7687%。结果表明,通过补料发酵方式,可以解除高浓酵、通入空气3种通气方法,研究对粟酒裂殖酵母同步度底物抑制发酵等问题,提高乙醇得率,同时可以避免糖化发酵菊芋生产燃料乙醇的影响。一次性投料发酵醪黏度太高,造成发酵困难,理论转化由图3可见,通入100mL/min氮气进行厌氧发酵和率下降,底物利用不完全。不通入任何气体进行乙醇发酵,48h都进入发酵末期,此时其乙醇浓度和理论转化率分别达到6647gL8575%和6576g/L、8483%,没有显著差别。试验结果表明,维持一个厌氧的发酵环境不能显著提高乙醇产量这是由于虽然保持厌氧环境有利于乙醇发酵,但影响酵一还原糖母的生长繁殖。通入100mL/min空气进行好氧发酵时,在发酵初期对乙醇发酵没有影响,反而对乙醇发酵有促进作用,但24h后,乙醇产量增速下降,72h,其乙醇000浓度和理论转化率分别仅为5513g和71.12%,出现这种现象是由于通空气进行好氧发酵的初期促进酵母细胞163248648096112的繁殖,有利于乙醇发酵,但随着发酵时间的延长,持发酵时间/h续向发酵液通气导致巴斯德效应出现,发酵初期其总糖图4菊芋粉分批补料发酵降解速率高于厌氧发酵也说明了这一点。但有研究指出Fig 4 Fed-batch fermentation of Jerusalem artichoke flour在乙醇发酵过程中供应必要的氧气是提高酵母菌增殖和高浓度乙醇发酵的保障措施,何向飞等5报道适量通粟酒裂殖酵母发酵菊芋粉产乙醇其糖化与发酵同步氧对采用高细胞密度和高强度乙醇发酵是必要的。因此完成,由图4可知,还原糖含量在发酵过程中与总糖含在进行菊芋粉高浓度乙醇发酵时,有必要进一步研究供量同步下降,发酵过程中没有还原糖的积累,因此避免氧对其影响。了发酵液中高浓度果糖对乙醇发酵的抑制,同时由于粟酒裂殖酵母能分解菊粉,原料不需蒸煮和预先糖化,可◆100mL/min氮气“0未通气100mL/min中气直接进行发酵,与淀粉质原料相比,减少了液化和糖化100 mL/min氮气未通气大量的能耗,因此在工业化生产时,减少了液化和糖化设备的投资和能耗,乙醇的生产成本也得到降低。3结论1)对原料预处理方法、初始pH值、菊芋粉浓度影响乙醇发酵的因素研究表明:菊芋粉颗粒粒度越小,发酵效果越好,100目筛分的菊芋粉发酵时乙醇浓度和理论转化率分别达到6484g和8361%;对原料进行高压蒸汽灭菌处理时,115℃处理35min要优于121℃处理7220min,表明高温处理会产生抑制发酵的副产物;对不同菊芋粉浓度试验表明,浓度越高,乙醇浓度越高,但其图3通气量对 Schizosaccharomyces pombe乙醇发酵的影响理论转化率随原料浓度的增加而下降,因此,综合乙醇Fig 3 Impact of aeration rates on ethanol fermentation产量和理论转化率的因素,进行工业化生产时,菊芋粉with Schizosaccharomyces pomb浓度可以选择200~250gL。2)对未调控pH值和恒定pH值、通气对乙醇发酵影2.7菊芋粉的批式补料发酵研究响的研究表明:发酵过程中pH值的变化对发酵没有影分批补料发酵与分批发酵相比,流加发酵可以解除响,中国煤化工发酵48b,其乙醇浓底物抑制、葡萄糖效应和代谢阻遏等问题,可以得到较度分CNMH④气试验证明供氧会导高的转化率。因此在分批发酵的基础上,进行了菊芋粉致发酹息醇浓度卜陣,選入贰气维持厌氧环境和不的补料发酵试验。由图3可知,总糖浓度在发酵进入16h通入任何气体时酒精浓度、理论转化率相差不大,分别时快速下降,至40h时,总糖消耗速率显著下降,故选达到6647趴、8575%和6576g、84.3%择在此时间内进行补料,起始菊芋粉浓度为200gL,5L3)在分批发酵的基础上,进行菊芋粉补料试验,初发酵罐守蓐巍鼐2000mL,24h和32h分别流加300gL始菊芋粉浓度设定200gL,分别在发酵24b和32h2次汪伦记等:以菊芋粉为原料同步糖化发酵生产燃料乙醇补料至终浓度300g/L,发酵终点酒精浓度达到9481gL,from Jerusalem artichoke J]. Chinese Joumal of理论转化率为81.54%。Biotechnology, 2008, 24(11): 1931-1936.(in Chinesewith English abstract)[参考文献[9 Kim C H, Rhee s K. Ethanol production from Jerusalemartichoke by inulinase and Zymomonas mobile ]. Applied[1] Sanchez O J, Cardona C A. Trends in biotechnologicalproduction of fuel ethanol from different feedstocks). [10) Ohta K, Hamada S, Nakamura T. Production of highconcentrations of ethanol from inulin by simultaneous[2]薛洁,王异静,贾土儒.甜高粱茎秆固态发酵生产燃料saccharification and fermentation using Aspergillus niger and乙醇的工艺优化研究[门.农业工程学报,2007,23(1)Saccharomyces cerevisiae[J]. Applied and EnvironmentalMicrobiology,1993,59(3):729-733Xue Jie, Wang Yijing, Jia Shiru. Optimization of the [11] Nakamura T, Ogata Y, Hamada S, et al. Ethanol productiontechnology for solid-state fermentation of sweet sorgfrom Jerusalem artichoke Tubers by Aspergillus niger andstems to produce fuel ethanol[ J]. Transactions of the CSaESaccharomyces cerevisiae[J]. Jourmal of Fermentation and2007, 23(11): 224--228. 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Food and Bioengineering Department, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China;2. Food and Bioengineering Department, Henan Universiry of Science and Technology, Luoyang 471003, China)Abstrag ased on the ability of Schizosaccharomyces pombe to ferment inulin-containing extracts into ethanol, the农业工程学报2009年production of fuel ethanol by simultaneous saccharification and fermentation(SSF) using Jerusalem artichoke flour asraw material was presented. The effects of raw material treatment, Jerusalem artichoke flour concentration, initial pHvalue on the ethanol fermentation performances of Schizosaccharomyces pombe were investigated in a shaking flask, atthe same time, the effects of the constant-pH fermentation and the uncontrolled-pH fermentation, aeration rate on theethanol fermentation were also studied in a 5 L jar fermenter. Experimental results showed that the optimum initial phvalue was 4.0, Jerusalem artichoke flour particle size was below 0.15 mm, high temperature treatment at 115C for35 min was better than that at 121C for 20 min. According the optimum conditions for producing fuel ethanol, themaximum ethanol yield of 66.58 g/L, equivalent to 85.88% of the theoretical yield, was obtained for the slurry with asolid concentration of 200 g/L at 30C after 48 h of incubation in a shaking flask. the decrease of ph value of the brothhad little effect on ethanol fermentation. The aerobic condition resulted in lower ethanol yield than strictly anaerobiccondition and non-aeration condition. The ethanol concentration was a little difference between strictly anaerobiccondition and non-aeration condition. Ethanol production by fed-batch fermentation was investigated and the maximumethanol concentration of 94.81 g/L, equivalent to 81.54% of its theoretical value, was reached with final Jerusalemartichoke flour of 300 g/L in a 5 L jar fermenter. These results provide a scientific basis for fuel ethanol production fromJerusalem artichokeKey words: ethanoL, fermentation, biomass, bioenergy, simultaneous saccharification and fermentation, Jerusalemartichoke. Schizosacche中国煤化工CNMHG