聚乙二醇活化酯修饰重组人白细胞介素-2

广东技术师范学院学报2006年第4期Joumal of Guangdong Polytechnie Nornal UniversityNo. 4, 2006聚乙二醇活化酯修饰重组人白细胞介素-2邹险峰张焕杨丛飞于中民(吉林大学生命科学院,长春130023; 长春长生基因药业公司,长春130061)摘要:目的 研究单甲氧聚乙二醇三聚氯氰(Methoxypolyethylene Clycol activated with ecyanunie choride ,Cc - mPEG)和单甲氧聚乙二醇硝基苯基碳酸盐(Methoxypolyethylene Glycol p - nitrophenyl carbonate, NC - mPEG)两种PEG活化酯修饰重组人白细胞介素- 2(hIL.-2)的修饰条件和修饰后的性质。方法在不同反应条件下用CTLL-2细胞/MTT法测定rhlL-2修饰后的生物学活性。结果随着PEG活化酯的摩尔比提高,修饰率增加,用CC-mPEG修饰rhlL-2后生物学活性损失很大，PEG400的加入可以降低CC- mPEG的投料摩尔比; NC-mPEG修饰的rhlL.-2后生物学活性基本保关键词:重组人白细胞介素-2;聚乙二醇活化酯;化学修饰中图分类号:Q 815文献标识码:A文章编号: 1672- 423X(2006)04- 0119- 03人白细胞介素- 2是机体免疫调节网络中的核心CTL-2细胞由长春长生基因药业公司提供物质，在临床上主要用于治疗和辅助治疗各种恶性肿1.3 仪器瘤和感染性疾病。重组人白细胞介素- 2不具有天然PAC3000型电泳仪, Bio- rad公司; GS- -700 型扫人白细胞介素- 2的糖基化结构，有免疫原性,大剂量描分析仪, Bio- rad公司;RC03000型CO,培养箱,美国使用易产生抗原抗体反应,而且体内半衰期短,溶解度REVCO公司;190型酶标仪,美国分子生物公司。差,这些限制了它的临床应用“"。聚乙二醇(polyethylene二、方法glycol, PEG)是-种无毒、亲水、中性的多聚物,聚乙二醇修饰蛋白质可以降低免疫原性、延长生物半衰期及2.1rhlL-2和CC-mPEG投料摩尔比对修饰提高水溶性2。在70年代末，国外开始了聚乙二醇化产物的影响: 二者的摩尔比分别为1: 10、1:40、1: 80,药物的研究热潮，目前已有多种药物进人临床研究或反应lhr后,8%冰醋酸终止反应，取样SDS-PAGE非上市，其中罗氏公司的聚乙二醇化干扰素a2a(派罗还原电泳 ,并测定其生物学活性。欣)也已经在我国上市。本研究采用单甲氧聚乙二醇三2.21% 的PEC4000的加入对CC - mPEG修饰聚氯氰(CC - mPEG)和单甲氧聚乙二醇硝基苯基碳酸rhIL- 2的影响:于rhIL- 2溶液加入1%的PEG4000,盐(NC - mPEG)两种PEG活化酯修饰rhlL-2,对修饰rhlL- 2和MPEG - CC的摩尔比分别为1:3、1:5.1: 10,条件进行了优化,并对修饰结果进行了分析。反应Ihr后,8%冰醋酸终止反应,取样SDS-PAGE非还原电泳,并测定其生物学活性。一、实验材料2.3rhIL-2和NC-mPEG投料摩尔比对修饰1.1 原料和药品.产物的影响:二者的摩尔比分别为1: 10、1:20、1:40,反hlL- 2半成品为长生基因药业公司提供;单甲氧应lhr后,8%冰醋酸终止反应,取样SDS-PAGE非还聚乙二醇三聚氯氰(CC - mPEG)和单甲氧聚乙二醇硝原电泳，并测定其生物学活性。基苯基碳酸盐(NC - mPEG) (MW = 5000)及PEG - 40002.4rhlL-2和NC-mPEG反应时间对修饰产(分析纯)购于Sigma 公司;低分子量电泳标准蛋白物的影响:于hlL.- 2溶液中按1: 30 摩尔比加入(Phamacia公司) ;其余药品试剂均为分析纯。MPEC中国煤化工2h、12h, 8%冰醋酸终1.2 细胞株止反|YHCNMHG电泳,并测定其生物收稿日期:2005- 12-02作者简介:邹险峰(1971-),男,吉林省长春市人,吉林大学生命科学院博士,从事生化药学和酶学研究。●120.邹险峰:聚乙二醇活化酯修饰重组人白细胞介素-2第4期学活性。2.5生 物学活性的测定:采用thlL- 2依赖细胞株CTLL- 2细胞/ MTT法咧，用国家标准品校准确定(IU)。.45三、结果3.1随着 CC - mPEG(MW5000)投料摩尔比的增图3 thL-2与 NC- mPEG不同摩尔比的修饰产物SDS -PACEI,hlL- 2;2,标准蛋白;3,4,5, hlL- 2与NC - mPEG的摩加，修饰产物的相对分子质量增加，当rilL-2与CC-尔比分别为1:10, 1:20, 1:40.mPEG摩尔比为1: 10时,修饰率很低;当二者摩尔比提3.4随着 NC- mPEG( MW5000)投料摩尔比的固高到1: 40时,基本修饰完全,修饰产物主要为两分子定,延长反应时间从1小时到12小时,修饰率提高,但PEG的修饰物和四分子PEG的修饰物两者修饰产物，产物有大分子多聚物转化的趋势,见图4。但是活力回收很低;提高摩尔比到1: 80时,修饰产物主要为大分子多聚物，活力几乎完全丧失,见图1。970006600045000300002010014400图4不同反应时间的 NC - mPEG修饰产物SDS- PAGE1,标准蛋白;2,3,4,反应时间分别为1h, 2h, 12h图1thL-2与CC-mPEG不同摩尔比的修饰产物SDS-3.5采用CC- mPEG(MW5000)修饰rhlL-2,修PAGE1,2,3, rhlL-2与CC - mPEG的摩尔比分别为1: 80, 1:40,饰后生物学活性下降很多，从修饰前的总活力为1: 10;4,标准蛋白;5.,hlL.-2.3.2随着 1%PEG4000的加人，可以大大降低6.08X 10'下降到6.55X 10*; 而采用NC - mPEGCC - mPEG(MW5000)投料摩尔比。当thlL-2与CC-(MW5000)修饰rhIL- 2,修饰后生物学活性基本保留，mPEG摩尔比为1: 10时,基本修饰完全,见图2。但活从修饰前的总活力为6.75x 10'下降到6.60X 10’。力损失很大,而且修饰物极不稳定,很快就完全丧失活讨论rhIL- 2是由133个氨基酸组成的单链多肽，相对力。分子量为15000- 17000道尔顿,属于小分子蛋白质,有3个半胱氨酸残基,分别位于第58位、105 位、125 位,三第58位和第105 位半胱氨酸残基形成二硫键。这样IL- 2才具有折叠结构，才能表现出生物学活性(4|rhIL-2分子还包含11个赖氨酸,应用PEG与rhIL- 2的非必需基团-赖氨酸残基的自由氨基共价结合，可提高蛋白的相对分子质量,延长半衰期,同时由于PEG图2 rlL.-2 与CC - mPEG不同摩尔比(含1%PEG4000)的修分子的屏障作用，降低免疫原性和酶解几率。饰产物SDS- PAGEI, 2, 3, rhll- 2与CC - mPEG的摩尔比分别研究表明，PEG活化酯和rhL-2的投料摩尔比为1: l0,1:5, 1:3;4,hlL-2; 5,标准蛋白.是影响修饰反应的关键因素。无论CC - mPEG还是3.3随着 NC - mPEG(MW5000)投料摩尔比的增NC - mPEG,随着PEG活化酯投料摩尔比的增加,修饰加,修饰产物的相对分子质量增加，当thIL-2与CC-率提中国煤化工量增加。CC-mPEG修mPEG摩尔比为1:10时,修饰率很低;当二者摩尔比提饰 t|YHCNM H G很多,而且产物极不稳高到1:20时,产物主要为两分子PEG的修饰物,活力定; NC - mPEG修饰hlL.- 2后生物学活性基本不变，几乎完全保留;提高摩尔比到1: 40时，修饰产物成分而且产物比较稳定。究其原因,可能是thlL- 2分子包较多,见图3。含的11个赖氨酸残基的自由氨基有的在分子表面，这.第4期邹险峰:聚乙二醇活化酯修饰重组人白细胞介- 2些自由氨基经PEC修饰后不会影响到thlL-2分子的投料摩尔比下 反应1小时修饰率已经很高，修饰后生生物学活性，但如果PEG修饰的是hIL-2分子内部物学活性基本保留，说明NC - mPEG首先修饰的是的赖氨酸自由氨基,会导致rhlL.- 2分子的空间结构改NC-mPEG分子表面赖氨酸的自由氨基，不破坏它的变,而影响其生物学活性。CC-mPEG可能是活化能力空间结构，所以，修饰物保留了hL- 2分子原有的生很强的PEG活化酯，可以将thlL-2分子内部的赖氨物学活性和稳定性。酸自由氨基活化，导致rhlL- 2分子的空间结构的变有关修饰产物分离纯化和其他理化性质还在深人化,生物学活性和蛋白的稳定性都随之下降。还有一种研究中,将另文发表。可能是高摩尔比的CC-mPEG既是rhlL-2分子的活参考文献化剂又是变性剂，当加人高浓度的CC- mPEG后,引起rhlL- 2蛋白部分变性，变成部分松散的线形结构，然[1]Rosenberg SA, Lotze MIT, MUUL LM,et al.A progress report on the后CC-mPEG对赖氨酸自由氨基活化修饰，由于treatment of 157 patients with advanced cancer using lymphokine -hlL.- 2分子天然结构的改变,稳定性下降,所以很快activated kllr cells and interleukin - 2 or high - dose inter-leukin - 2 alone. N Engl J Med.1987 Apr 9;316( 15) : 889-97.丧失活性。PEG4000 的加入可以使CC - mPEG的投料摩尔比降低，修饰率提高,但并不对rhlL-2分子的生[2] Molineux G. Pegylation: engineering improved pharmaceuticals forenhanced therapy[J] .Cancer Treat Rev . 2002, 28(Suppl A):13-物学活性构成保护。这可能是因为CC - mPEG在水相中易水解，而PEG4000可能是CC - mPEG的水解产物[3]中国生物制品标准化委员会编.中国生物制品规程[M]或产物类似物,抑制了水解反应,所以摩尔比下降。因.2000版,化学工业出版社.此,经研究推断, CC - mPEG不适合于修饰hlL-2,如[4]Tsuji T, Nakagawa R, sugimoto N, Fukuhara K. Characerzaion of果有其它分子可用CC - mPEG来修饰时，可尝试加入disulfide bonds in recombinant proteins: reuced human interleukinPEG4000，看能否降低投料摩尔比。研究同时表明,2 in inclusion bodies and its oxidative refolding . Biochemistry.1987 Jun 2:;26(11):3129- 34.NC - mPEG对thIL- 2分子的修饰反应温和，在适当的Chemical Modification of rhIL- 2 with Activated PolyethyleneZou Xianfeng'Zhang huan', Yang congfei? Yu Zhongmin(1.College of Life Science , Jilin University ,Changchun 130012, China)(2.Changchun Lfe Gene Pharmaceutial Limited Company ,Changchun 130061 ,China)Abstract: Purpose To study the condition of modifying rhlL.- 2 with CC - mPEG and NC - mPEG. Methods RhIL- 2 wasmodifed by activated PEG under various conditions and the bioactivity of the modified rhIL- 2 was analyzed by CTLL- 2cell. Result Along with the increase of the activated polyethylene ,modified rhlL- 2 was increased. The bioactivity of rhlL- 2modified by CC - mPEG was reduced too much, though the incorporation of PEG400 could reduce the use of CC - mPEG, Butthe bioactivity of rhIL - 2 modified by NC - mPEG was saved.key words: RhIL- 2; Activated polyethylene glycol; Chemical modification中国煤化工MYHCNMHG