花色改造基因工程

中国生物工程杂志第23卷第7期CHINA BIOTECHNOLOGY2003年7月花色改造基因工程李洪清!∵”李美茹2潘小平2陈贻竹Q4、a18A(1华南师范大学生命科学院广州510312中国科学院华南植物研究所广州510650)摘要自1987年世界首例成功运用转基因技术改造矮牽牛花色以来,花色改造基因工程技术不断展现它在培育新花色品系上的无穷魅力。介绍了近年来运用基因工程技术成功改逵花色的3种主要策略:(1)采用反义RNA及共抑制的方法来改变花颜色的深浅;(2)通过导入新基因产生新奇花色;(3)利用转座子构建特殊表达载体随机激活花色合成的基因来产生嵌合花色。此外,还对转基因株花色不稳定原因进行了讨论。关键词花色花色素苷基因工程花是观赏植物的主要观赏器官。自然界花色与内源的互补mRNA结合,使mRNA不能合成蛋白种类繁多,但一些重要花卉的色彩不全,如月季、郁质,以此达到抑制靶基因表达和修饰目标性状的目金香、康乃馨缺少蓝色和紫色;非洲紫罗兰、仙客的,从而实现花色的改变。1988年, van der Krol来、天竺葵矮牵牛缺少纯黄色;鸢尾、紫罗兰等缺等首先采用此法获得了矮牵牛花色变异新品种少红色和砖红色,这些是运用传统杂交育种方法无他们将编码查尔酮合成酶( chalcone synthase,CHS)法解决的问题。因此,对花色基因的研究具有重要的结构基因反向导入矮牵牛植株,转基因株的花色意义,一方面使人们有可能对花色进行人工修饰,由紫色变成白色,且不同株系表现出不同程式的花进一步提高其观赏和商品价值;另一方面,由于花色变异。Ada等2分别将反义DFR( dihydroflavonol色的明显可见性,花色基因可作为看得见的标记基4 - reductase)和CHs导入蓝猪耳中,转基因株系的因,用于研究基因的表达、调控等。花冠花色素苷含量均呈不同程度的减少,结果产花色素苷是影响花色的主要色素,控制花从红多种新花色图案,如花冠檐上深着色部分呈波浪形色至紫色、蓝色的一系列变化,其含量的增高或降或某些唇瓣着色较深。转反义CHS的株系,花筒低都可能改变花的颜色。目前对属于类黄酮的花和花冠檐的花青素色苷均同等程度减少,花色趋色素苷的合成代谢以及与之相关的基因研究得较红;而转DFR基因株系冠檐的花色素苷含量减少为深入,而且已被应用于改造花色的实验中。下面程度比冠筒的大,转化株积累了大量的黄酮、黄酮介绍成功地进行花色改造的基因工程技术和成果。醇物质,因而转化株的花色显得更蓝。一般而言,采用反义RNA技术转化结构基因,均在不同程度1花色变淡上减少花青素苷的含量,花色也相应地变淡。该方导入植物内源色素基因的反义( antisense)基因法也已成功地应用于改造其它多种花色上3或正义( sense)基因,抑制内源色素基因的活性,造1.2共抑制法( sense suppression或 cosuppression)成无色底物的积累,使花色变淡或变白。即通过导人一个(或几个)与内源基因同源或1.1反义RNA技术( antisense suppression)异源(但序列应与内源基因具高度同源)的基因,达将某一基因反向插入植物表达载体,然后导人到抑制该内源基因转录产物的积累,进而抑制该内植物体内,这种“错误”的DNA转录成RNA之后,源基因表达的技术。共抑制现象是1990年在Jorgenson教授实验室发现的,他们本想将CHS导收稿日期:200207-28修回日期:200305-19入矮牵牛,通过CHS在细胞中的超表达国家自然科学基金资助项目(30170667),全国100篇优秀博士文作者与专项基金资助项目mYH中国煤化工实验结果出乎他,电子信箱:hqgi@senu,ehu,cn成受到抑制,42%CNMHG第7期李洪清等:花色改造基因工程的转化株产生完全白花和紫白嵌合花。但转化株有的基因导入其中,从而使该受体植物增加一个或花色的遗传不稳定。现在共抑制现象已在多种植几个新的性状。将该原理应用于花色基因工程操物上发现并应用于基因功能、基因活性网络调控的作上,可以产生新奇花色。DFR分别将香橙素研究上。Aida等分别将DFR和CHS导入蓝猪耳( dihydrokaempferol DHK)、双氢槲皮素中,转基因株系的花冠花色素苷含量均呈不同程度( dihydroquercetin)、双氢杨梅树皮素的减少,位于花筒的花色素苷含量减少程度大于花( dihydromyricetin)还原成相应的白天竺葵苷元冠檐花筒的颜色几近白色。发生共抑制与导入基( leucopelargonidin)、白矢车菊苷元(ooin)和因的拷贝数以及2个基因之间的同源性程度密切白飞燕草苷元( (leucodelphinidin)这些都是花青素相关M。在矮牵牛的花冠组织中有2个CBS基的前体。矮牽牛的DFR不能将DHK作为底物,只因:CHSA的mRNA约占90%,CHSJ的占10%,这对双氢杨梅树皮素有还原作用。因此,在矮牵牛两个基因在编码区处具85%的同源性。导人中,存在有花青素和翠雀素的衍生物,但缺少天竺CHSA编码区的开白花的矮牵牛中不仅CHSA被葵的衍生物。矮牵牛突变种RI01积累大量DIK抑制而且CHSJ也被抑制。这说明产生共抑制并m和双隐性,缺少F3H活性,只有极低的不需要2个基因序列完全相同。菊花的CBS和}35H活性,含极少量的花青素和花翠素衍生物,DFR基因与矮牵牛的具70%的同源性。当将来源无天竺葵青的衍生物,花近白色。玉米编码DFR于矮牵牛的CHS导入矮牵牛中,48个转化株中有基因A能将双氢槲皮素催化成花青素衍生物。8株出现共抑制现象,而换成来源于菊花的CHSMeyer等将A基因导入R01中,转化株积累了则在调查的97株转化株中,没有发现有共抑制的天竺葵糖苷,没有DHK,花为砖红色。这也说明了现象。改用DFR也得到同样的实验结果。转化来源于玉米的A基因编码的DFR酶不象矮牵牛牵牛的西A基因导人矮牵牛W80和W85后,不同的DR酶样,对底物极其专一。但以上获得的品种的转化株花色改变程式不同,发生在W85株转化花颜色极不稳定,最终花呈多种颜色,如白系中的嵌合花色更多。最近, Shimada等m将矮牵色、杂色和红色。Elma等比较了来源A基因牛的FySH基因导入细胞中存有F35H基因的和非洲菊DFR(g4)基因在RL0中的表达情况矮牵牛(vars. Falcon Blue, Cascade Royal,花为深蓝发现转A1基因的植株花颜色较淡,且随生长发育色)中,发现转基因植株的花为淡蓝、淡红色,推测时间发生变化,这与导人RL0多拷贝基因和35S这是由于外源基因与内源基因通过共抑制,降低或启动子和 AI cDNA发生甲基化有关。转刚基因抑制了F35H基因的表达引起的。的植株,花色泽深且稳定,这与 gdfr cDNA中GC含反义RNA技术和共抑制技术在改变花色显现量低,不易发生甲基化有关。 Davies等田将苜蓿上有明显的区别。 Jorgensen等比较了转反义CHR( chalcone reductase导人矮牵牛,发现转化株花CHS和正义CHS矮牵牛株系花颜色的变化,发现的颜色从白色变为黄色,这是因为转化株中积累了转反义CHS仅影响花冠的颜色,但转正义CHBS不大量6脱氧查尔酮的缘故。转辣椒红素合成酶基仅影响了花冠的颜色,而且影响了花药、茎和叶的因的烟草植株叶片中由于积累辣椒红而呈红颜色,特别是影响了花简的颜色。两者所产生的新色。来源于单细胞绿藻 Haematococcus pluvialis花色图案也不同,导入反义CHS产生白色区,白色的编码P胡萝卜素酮酶基因,被定向导人烟草蜜腺区域从花筒幅射到冠檐,而导入正义CES的株系,组织后改变了转化株胡萝卜素生物合成的途径,则在冠檐上产生白色的楔形或波浪形。Aida等在蜜腺组织中产生了虾青素该组织的颜色也相应在蓝猪耳上也观察到了同样的现象,即转正义CHS地从黄色变为红色。或DFR显著减少了花色素苷在花筒的积累。这同理论上可以通过超表达某一结构基因,以增强时也说明了相同基因在矮牵牛和蓝猪耳上发生共原有代谢产物的表达,达到加深花器官花色素苷的抑制的部分机理是相同的。含量。但目前该方法在改造花色研究中尚无成功增加新花色的报道。结构基因的活性由调节基因控制,目前已中国煤化工当植物组织由于缺将欲修饰的供试株及其近缘种植物中原先没TH一舌结构基因时,可以CNMHG中国生物工程杂志第23卷通过导入调节基因来改变花色。Loyd等6将玉米影响的目的基因是与花色素合成有关的结构基因的调节基因R和C导入拟南芥和烟草中,2种植物或调节基因时则不同细胞中的结构基因表达的时的转化株花色均由白色变为不同深浅的粉红色空不同,因而在不同细胞中生成的花色素苷不同,在观赏植物中,花卉的蓝色品系非常罕见,尤导致在同一花瓣上可能显现不同的颜色,形成美丽其是那些名贵花卉,如月季、百合、郁金香、香石竹、的嵌合花色。例如,在构建玉米Lc基因的表达载菊花等均缺乏蓝色的品种。人们期望将编码F35′体时,在lc基因编码区和CMv35s启动子之间插H基因引入缺乏F35H基因的玫瑰、香石竹中,使转座子Ac,转化番茄,由于Ac跳出之后,Lc基因原合成花葵素苷和花青素苷的代谢方向转向翠雀的表达导致在番茄的叶子和果实上产生深红色的素糖苷的合成方向,从而使花变为蓝色花。斑点。2001年Liu等首次构建了一个转录因florigene公司将矮牵牛的F35H基因和D基因子R的表达载体,在启动子CaMV35s和R基因之导入白花的康乃肇中,转化株积累了大量的花翠间插入一个来源于拟南芥自主性的转座子Tagl,R素,花色也因而发生了改变,改变程度与导入的基基因调节花色素苷合成途径中的多个结构基因(如因的表达强度相关。该公司现已得到2个商品的CHS、DFR、UFGT、F3H、CH等)的表达。实验表品系,分别为 Moondust"(花为淡紫色)和明转基因的烟草的花产生多种美丽的嵌合花色。Moonshadow(深紫色),先后在1996年和1997年投放到市场。最近该公司报道将F35H基因和4问题与展望CyTP65基因同时导入康乃馨中,花色从原来对照虽然第一例利用基因工程技术改造花色的实株的红色转变为深紫色。但细胞中含有高含量的验诞生于1987年,距今已有10多年,在这段时间花翠素并不意味着花瓣就能呈现理想的蓝色,里已在多种植物上成功地进行了花色基因工程技Shimada等将来源于龙胆的F35H的cDNA术操作,但至今我们仍难随心所欲地控制花色。究7G1导入开粉红色花的烟草( Nicotiana tabacum cv.其原因,主要是因为花色的形成受多种因素的影Petit Havana srl,该植物缺少F35H酶),同时还将响例如,在一些植物中蓝颜色是翠雀素与适当的来源于矮牵牛的F35H酶的cDNA—AK4导入因素如助色素、金属复合物、液泡pH值等相互作矮牵牛(var.Flon,该植物缺少F3'5'H酶,花呈粉用而产生)。这就是为什么虽然最早分离转化红色)中,转化株均积累了花翠素的衍生物,花色从F3,5H基因,进行培育蓝色月季的研究始于1993粉红变为洋红,在所有的转化株中均没有蓝色的年,但至今还未有成功培育蓝色月季报道的原因。花。花翠素的含量在转基因的矮牵牛中远高于在 Forkmann2)将影响花色显现的有关花色基因分为转基因的烟草中。在转基因的矮牵牛中,花色图案以下几类:(1)控制黄酮类生物合成单个步骤的基也发生了变化,出现新的星型图案。蓝色花的形成因;(2)与黄酮类修饰有关的基因;(3)开关全部或除与液泡中的色素有关外还与助色素、金属离子、部分合成途径的调节基因;(4)影响黄酮类浓度的液泡的pH值密切相关,人们正在从影响蓝色花形基因(增强或减弱色素合成;阻止色素积累;引起酶成的诸多因素中找到培育蓝色玫瑰等花卉的突破促或化学褪色);(5)与花朵特定结构有关的基因(花瓣特定部位色素不同的产生或积累,花嵌合体3嵌合花色的形成;转座子引起的基因不稳定表达);(6)影响花色的基因或因子(共着色;黄酮类与金属离子的嵌合花色具有很高的观赏和商业价值,自然界互作;液泡pH值);(7)控制花瓣毛、乳突、色素细胞中部分嵌合花色是由于转座子引起的。利用转座的形状和分布、角质层类型等形态特征的基因2。子插入法可一次获得较多种类的突变体,例如van因此,也许随意操作以上花色基因的表达,将影响Houwelingen等利用内源转座子(TEs)插入矮牵着花颜色的表达。牛,获得55个新的花色突变体。转座子通过插入目前我们对于3大类色素生物合成途径产生或割离目的基因而关闭或恢复基因的表达活性。色素变化的认识仍然有限,花颜色形成过程的调控由于不同细胞中转座子跳出的时间不同,因而不同很复细胞中的目的基因的表达时空不同,如果被转座子在植中国煤化工与。而且转基因沉默等)很难控CNMHG第7期李洪清等:花色改造基因工程制,这可能是迄今为止所进行的改变花色的遗传操Plant Mol Bio, 1996. 957-973作存在不稳定性的原因所在。实验表明转转录因[9 I Huits H S M. Gerats A G M, Kreike MM, et al. Genetic: control of子的植株,特别是由于转座子对基因表达活性的影dihydroflavonol I-4-reductase gene expression in Petunia hybridalant J.199,6:295-30响,使花色变异程度很大。花色素基因分子调f 10] Shimada Y, Nakano-Shimada R Ohbayashi M, et al. Expression of控途径的研究是目前花色基因工程的研究热点。虽然目前距离定向花色育种的实践仍有一定transgenic tobacco and petunia plants. FEBS Lett, 1999, 461: 241距离但从已知实验结果表明基因工程技术操作使花色变异更大,这意味着通过此途径易获得新花色I Meyer P, heidmann I, Forkmann G, et al. A new petunia flower品系,这一点与观赏植物产业追求新颖的倾向相by transformation of a mutant with a maize geneNaue,l987,332:677~678符。总之随着基因活性调控机理的揭示和基因操12EmaP, Helariutta Y,cmhR.std. Transgene inactivation作技术的进步,花色基因工程将展示更为广阔的应n Petunia hybrida is influenced by the properties of the foreign用前景。gene. Mol Gen Genet, 1995, 248: 649-656[13 1 Davies K Bloor S, Spiller G B, et al. Production of yellow colour in参考文献flowers: redirection of flavonoid biosynthesis in Petunia. Plant J1998,13:259[I I van der Krol A R, Lenting R I, Veenstra J Get al. 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The three effective methods successfullyed in developing novel colors were reviewed: changing flower colors by anti-sense and sense suppression technologycreating novel flower color by expression of new foreign genes; making variegated flower color by random activation ofanthocyanin gene expression through transposon strategy. Finally, the problems and perspectives of genetic engineering offlower color were discussedKey words Flower color Anthocyanin Genetic engineering Transponson耐高温消毒pH电极和D(溶解氧)电极耐高温消毒 GKFpH电极和DO(溶解氧)电极是我所科技项目成果产品,pH电极曾获得“七五”攻关重大科技成果奖、中国科学院科技进步二等奖,广泛应用于制药、生化制品、味精、食品发酵、石油、血制品、化工等行业的在线检测能适时掌握生产过程中pH、DO参数的变化,是提高产品质量、产量的重要手段pH电极和二次仪表经上海技术监督局和化工部化工专用仪器仪表质量监督检验中心随机检测,结果表明,该产品性能指标和产品质量优良。通过几代申东人的奋斗,目前产品质量更尽善尽美。主要技术指标1.pH电极测量范围:pH-12灭菌温度:105~150℃测量范围:10~95℃插人深度:125,150,180,200,250mm(可根据客户要求特制)安装方式:通过护套与发酵罐连接或通过法兰与反应釜连接,配套工业pH计,测量范围分辨率:pH0.01输出信号:0~10mA或4~20mA标准电流开口尺寸:138mmx138mm(表盘)在非机械损伤条件下,玻璃电极寿命长于20批罐(灭菌条件130℃,30min)2.DO电极检测系统:原电池测量范围:0%-100%响应时间:90%响应小于760s灭菌条件:120~130℃,0.17MPa二次表输出信号:0~10mA或4~20mA我厂生产的pH电极和DO电极品种齐全,能与各种规格发酵罐和反应釜配合使用,能应用于各种场合各种介质,几何尺寸采用国际统一规格,能与进口产品替换,也可根据用户要求特制。制造计量器具许可证编号:沪制0240122上海申东生化传感器厂联系地址:上海市定西路1295号中科院上海硅酸盐研究所邮编:200050联系人:任国鑫丁晓聪中国煤化工电话:(021)62208693手机:13901821285传真CNMHG