多肽固相合成

科技论坛多肽固相合成宋晓骥王立策(吉林化工职业技术学院吉林市特殊设备检验中心1320000摘要:多肽固相化学合成法是蛋白质研究领域非常重要的研究方法之一,可分为 Merrifield和Fmoc方法,在生物药物、蛋白质工程、免疫学等研究中得到了广泛的应用。介绍了多肽的固相合成法,包括多肽合成原理、固相多肽合成的分类、合成步骤。关键词:多肽;固相合成;方法;分类;步骤1概述量,其他氨基酸活化的方法为4 eq Fmoc保护氨基酸、3.6cq自 Merrifield刨立并发展固相合成多肽方法,使得多肽合成领 mmolHBTU、4HOBt和8 eq. DIPEA溶于40 mLDMF中,将反应液域取得了重大突破,对生化、医药、免疫及分子微生物学等领域起到加入固相反应器中室温摇荡2小时。耦合完毕后,用 Kaiser's试剂进了巨大的推动作用。随着对连接分子、脱除方法和保护基的不断研行检测,若反应呈现阳性说明耦合不完全,重复耦合步骤究,近年来固相方法在多肽合成上的应用发展迅速。利用这一方法2.33多肽的切除和沉淀几乎能够高收率地制备任何多肽。树脂用DCM洗涤几遍后,真空抽干。往装有树脂的多肽固相反1963年, Merrifield提出固相合成多肽的思想,现在固相多肽合应器中缓慢加入:三氟乙酸/三异丙基硅烷/水(TFA/ms/HO)成技术已经成为多肽合成中的一种常规技术,除了 Merrifield当年=95/2.525(w)溶液50mL,反应3小时。过滤,氮气吹去大部分的建立的Boc固相法外,1978年 Meienlofer和 Atherton等人采用溶剂后,向残液中倒入20.0mL无水乙醚,出现白色絮状沉淀,在Carpino报道的Fmoc基团作为氨基保护基,成功的进行了多肽合4000RM转速,5℃条件下离心5分钟,倒去溶剂乙醚,向沉淀中加成。Fmoc固相法已得到广泛的应用并愈加受到人们的重视。多肽固入无水乙醚200mL,振荡,同样条件下离心5分钟,再重复一次,除相合成法在药物研究领域、蛋白质结构研究领域、免疫学研究领域去大部分的杂质。沉淀真空干燥24小时。固体残留物用离子水溶呈现着不可比拟的优越性。多肽固相合成法在生物制药及蛋白质工解,冷冻干燥得到白色絮状固体,-20℃保存。程中有着广阔的应用前景234多肽的分离纯化目前,大量合成多肽,可以采用多肽合成仪,通过改进多肽合成将冻干的粗品多肽,溶于20%乙腈/水溶液进行高效液相色谱仪的功能,可使合成过程完全自动化,从而提高合成效率,节约试(HPLC)分离。HPLC在 Waters-600E多通道系统上进行,选用DE-剂,降低成本。Ⅴ ELOSIL ODS-UG-5C18半制备柱。(10.0×250mm)和Wa-2多肽固相合成ters-2487紫外检测器(A=215和254mm),或 Varian( Pro Star215)2.1原理CC1254 nucleodur cl8 gravity制备柱。用含有0.6%TFA的乙腈和首先对组成目的肽的氨基酸进行改造,使其成为氨基末端带有水溶液进行梯度洗脱。收集主要峰产物,进行电喷雾质谱或MAL保护基的氨基酸。将目的肽第一个氨基酸的羧基以共价键的形式与D-TOF质谱鉴定。减压旋蒸除去HPLC的样品锋中的乙腈。在冷冻固相载体相连,再以这一氨基酸的氨基为合成起点,使其与相邻氨干燥机上冷冻干燥,获得目标产物多肽,多肽样品-20℃保存。基酸的羧基发生酰化反应,形成肽键。然后让包含有这两个氨基酸24检测方法的树脂肽的氨基与下一个氨基酸的羧基反应,不断重复这一过程最终产物经过ESI-Ms方法鉴定,ES-MS采用软电离方式,电直至目的肽形成为止。接着目的肽从树脂上裂解,进行氧化折叠,这离后的分子化学键一般不会被破坏,因此可以直接得到较强的分子样得到了人上合成肽的粗产品。再进行纯化,化学修饰,进行活性鉴离子锋数据,试验得到目标化合物有分子离子峰、加钠的分子离子定。重复上述步骤,即缩合-洗涤-去保护-洗涤-缩合,直至得峰和加钾的分子离子峰。到目的肽链。质谱条件:样品溶解于甲醇,通过 Cole-Parmer74900注射泵打22分类入电喷雾质谱。电喷雾质谱条件:喷雾器压力为70或11.0Psi,干燥固相多肽合成在近几十年的发展中逐渐分化为2种类型。①器(N2)流速为40或80L分钟,温度为300℃。喷雾针电压为Merrifield固相合成,也称为Boc固相合成。② Atherton和 Shepar所4kV。发展的Fmoc固相合成法。由于脱Fmoc保护基以及将产物从树脂3结论上切下时反应条件温和,而且与Boc固相合成相比Fmoc固相合成多肽合成的成功与采用的活化偶联等方法有关,但更多的是的副反应少,所以Fmo固相合成法已经被广泛采用。取决于选择性保护脱保护策略。在“最小保护”策略下,醇和酚性羟Fmoc固相合成法是常用的多肽合成方法,其反应条件温和单基、巯基、甚至羧基都可以不加保护但只限于使用中度活泼的酰步反应产率高达98%以上。化剂,例如活泼酯。假如大量地试用酰化剂,或者当使用更活泼的中23固相多肽合成的基本步骤间体时,最小保护”策略就不适用。在固相载体上增长肽链,如果使以Fmoc策略固相合成多肽为例用酸酐或DCC-HOBt方法,就需要更大的保护,在极端情况下就是231树脂的活化最大保护”。在中等保护或最大保护策略中,脱保护时的选择性至取一定量的树脂置于固相反应器中,加入50mL无水DMF浸关重要。最终除去合成的肽链上的一切保护基是极为关键的操作,泡溶胀2小时,减压抽去溶剂DMF。应当引起极大的注意,以便保证组合起来的肽链不受伤害。新型2.32氨基酸的耦联Fmoc固相多肽合成方法的优越性正在逐渐为人们所认识。即以活化的Fmo-AA-0H4.0eg-Fmoc保护氨基酸、36 q HOBt和Fmo作为a-氨基的瞬间保护基,与作为C端羧基和一系列侧链eq DIPEA溶于40 mLDMF中。功能基的半永久性保护基(如Boc基)配套形成正交保护。每步偶联第一氨基酸耦联到树脂上的方法为4 leq Fmoc保护氨基酸之后,用弱碱溶液脱Fmoc保护肽键形成之后用三氟乙酸脱侧链保36 g HBTU和0.1 eq DMAP溶于40 ImLDMF中,加入8 eq DIPEA,室护。由于结晶性的活泼酯和Fmo-氨基酸的对称酸酐可以得到所温摇荡反应10小时,减压抽去溶剂,以DMF(4.0mL×5)洗涤树脂。以该研究方法切实可行并很快得到泛应用加入乙酸酐:吡啶:DMF=2:1:3的溶液60mL,摇荡30分钟,封闭树中国煤化工脂上未反应的官能团。依次用DMF(40mL×3),DCM(40mL×3)和CNMHGDMF(40mL×3)洗涤树脂,20%派啶/MF脱保护(4.mL×3),时间为10分钟和20分钟。然后开始进行接肽反应,每一轮都按表中程序进行。除了Fmoc-Ser/Thr(AcxB- 0-GlcNAc)OH是采用两倍用