生物素中有关物质的HPLC法测定

中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals2014,45(11)生物素中有关物质的HPLC法测定陈雪帆3,胡楚楚冫,赵盼盼2,郑国钢(1.浙江工业大学长三角绿色制药协同创新中心,浙江杭州310014:2.浙江省食品药品检验研究院,浙江杭州310004;3.杭州艾品医药科技有限公司,浙江杭州310014)摘要:建立了高效液相色谱法测定生物素的有关物质。采用C1色谱柱,以16.7 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH29):甲醇为流动相,梯度洗脱,检测波长210nm。在上述色谱条件下生物素与各中间体及降解产物均能有效分离,4种已知有关物质在1~20ug/m1范围内线性关系良好,平均回收率为933%~99.3%,最低检测限分别为0.365、0.280、0.255和0.480μgml关键词:生物素;有关物质;高效液相色谱:测定中图分类号:O65772:TQ460.72文献标志码:A文章编号:1001-8255(2014)11066-04Determination of Related Substances in Biotin by hPlcCHEN Xuefan", HU Chuchu, ZHAO Panpan, ZHENG Guogang(1. Zhejiang University of Technology Collaborative Innovation Center of Yangtze River Delta Region Green Pharmaceuticals, Hangzhou 3100142. Zhejiang Institute for Food and Drug Control, Hangzhou 310004; 3. Hangzhou Irvine Pharmaceutical Services, Hangzhou 310014)ABSTRACT: An HPLC method was established for the determination of the related substances in biotin. A CI8column was used, with the mobile phase of PBS (16.7 mmol/L, pH 2.9): methanol by gradient elution, at the detectionwavelength of 210 nm. Biotin and the related substances were well separated. The calibration curves for related substancesA-D were linear in the range of 1-20 Hg/mL. Their average recoveries were 93.3%-99.3%, and the low limits ofdetection were 0.365, 0.280, 0. 255 and 0.480 ug/ml, respectivelyKey words: biotin; related substance; HPLC; determination生物素(1)是多种羧化酶的辅酶,在羧化酶反效果好,专属性强,方法简便。应中起CO2载体的作用,它以游离形式或与蛋白1仪器与试剂质结合的形式广泛分布于动植物组织中(2。除经典1260型组合式全自动高效液相色谱仪,含G1311B型的合成路线外,另有采用(3aS,6aR)-六氢-2-氧四元泵、G4212B型二极管阵列紫外检测器和G1329BALS代-1,3-二苄基-1H噻吩并[3,4-d咪唑-4烯戊酸型自动进样器(美国 Agilent公司)。为原料,通过氢化、脱苄、环合制得15,该合成1对照品(中国食品药品检定研究院,批号过程中会产生有关物质A~D,结构式见图1。欧100291-200402);1原药(含量994%,批号120701;含量洲药典8.0版(EP8.0)采用TLC法控制1(经典路93%,批号120702和120703)及有关物质A~D(色谱线)中的有关物质。1含量及有关物质测定已有报纯度均大于95%)均由浙江圣达药业有限公司提供。甲醇道均不能有效测定后一种方法中产生的有关乙醇为色谱纯,磷酸二氢钾、磷酸均为分析纯,水为重蒸水。物质A~D。故本研究建立了HPLC法测定,分离2方法与结果21溶液制备收稿日期:201402-13:修回日期:201409-08作者简介:陈雪帆(1978-),男,副教授,从事化学药物的质量研供试品溶液:精密称取1原药适量,加50%乙宄与控制,药品质量标准的制订、复核及生物利用度的研究等。醇溶解并稀街m1的淀迹,摇匀,作为供Tel:013819183280试品溶液。中国煤化工E-mail:xfchen@aliyun.comCNMHG中国医药工业杂志 Chinese Journal of pharmaceuticals2014,45(11)1067人COOHy-cHeCOOCH,图1有关物质A~D的结构Fig 1 Structures of Related Substances A-D系统适用性溶液:分别精密称取Ⅰ对照品与灵敏度,使有关物质A色谱峰的峰高约为满量程有关物质A~D100mg,各置100ml量瓶中,加的20%;调节流速使1色谱峰的保留时间约7~50%乙醇溶解并定容,摇匀;精密量取上述溶液各10min,各组分出峰顺序依次为1、有关物质A、B、m,置同一100ml量瓶中,加流动相定容,摇匀,C和D,1与各有关物质的分离度应符合规定;理制成混合溶液(0μgm),作为系统适用性溶液。论板数按1峰计不低于3000。色谱图见图2。可见22色谱条件与系统适用性试验各色谱峰分离完全,理论板数以1峰计大于4000色谱柱 Agilent CIt8柱(46mm×250mm,5um)23专属性试验流动相16.7mmol/L磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾取本品50mg,共5份,各置50m1量瓶中227g,加水至IL,用磷酸调至pH2.9;A)∶甲醇加50%乙醇5ml摇匀,分别进行酸、碱、氧化、(B),梯度洗脱(程序见表1);流速1.0ml/min:检强光和高温破坏,分别取上述溶液用50%乙醇定容测波长210m:进样量20μl。(酸、碱破坏样品须中和),摇匀,进样。结果表明,1峰与各中间体、降解产物峰分离良好,1在表1梯度洗脱程序酸、碱性条件下较不稳定,1与主要降解产物均在Tab 1 Gradient elution Procedure210nm波长附近有较大吸收0→875:2524线性试验8→3575:25→20:80精密称取1对照品和有关物质A~D适量,20:8020:80→75:25加50%乙醇溶解并稀释,制成1、2.5、5、7.5、10、15和20中国煤化工,记录色谱图。取系统适用性溶液注入液相色谱仪,调节检测以浓度c为CNMHGNA,进行线性回中国医药工业杂志 Chinese journal of pharmaceuticals2014,45(l1)A:系统适用性溶液,B:供试品溶液1-1;2-有关物质A;3-有关物质B:4-有关物质C;5-有关物质D图2典型色谱图Fig 2 Typical Chromatograms归,得回归方程。1:A=8.004c-0.192,r09998;表21有关物质测定结果%有关物质A:A=40.784c-2.204,r=0.9999;B2 The Results of Related Substances in 1 1%A61.327c-2873,r0.9999;C:A=56.389c-3.444,有关物质A单一未知杂质未知杂质总量杂质总量0.140.120.130.27r=09999;D:A=51461c-4486,r=0.9998。表明0.120.130.270.120.251和有关物质A~D在1~20μg/ml浓度范围内注:"有关物质B、C、D均未检出线性关系良好。最低检测限(LLOD)分别为0.395、0.365、0.280、0.255和0480μgml3讨论2.5稳定性试验1为水溶性维生素,而其合成工艺中产生的中取供试品溶液分别于室温放置0、2、4、6、8间体杂质脂溶性较强,且有关物质B、C结构相近,和16h后进样测定,有关物质总峰面积的RSD>采用HPLC等度法难以洗脱各杂质,故采用梯度洗15%,表明供试品溶液应临用新制脱,分离良好26回收率试验经对1、有关物质A~D及各降解产物峰进精密称取1原药0.1g,置100ml量瓶中,分行UⅤ扫描,结果均为末端吸收,参考文献方法选别加入杂质A~D适量,制备低、中、高浓度质择210nm波长处测定6。分别比较乙腈与甲醇为控溶液(相当于主成分的004%、0.2%和0.3%),流动相有机相(7,结果显示乙腈为有机相时空白加50%乙醇溶解并定容,摇匀,取溶液进样测定。溶剂图谱中干扰峰较多,故选用没有干扰峰的甲醇。有关物质A~D的平均回收率为93.3%~99.3%,逐步调节流动性中有机相和水相比例,使各有关物RSD为30%~54%(n=9)。质在平缓梯度坡度出峰,并使有关物质B、C有效27有关物质测定分离。同时,取不同pH值(20~50)的磷酸盐缓精密吸取供试品溶液进样,记录色谱图,供试冲液进行试验,结果缓冲液pH值基本不影响各杂品溶液的色谱图中如有与上述有关物质保留时间一质出峰。由于1在酸性条件下较稳定,故参照文献致的色谱峰,采用外标法计算有关物质,单个已知选择pH29进行试验有关物质均不得超过0.5%;其他单个有关物质峰采用本法测定特定杂质,LLOD可达0.025%。面积不得大于对照溶液主峰面积的1/2(0.5%);各EP80/BP2013均采用TLC法测定有关物质,规有关物质峰面积之和不得大于对照溶液主峰面积定单个杂质小于0.5%,且最多允许一个杂质大于(1.0%)。结果单个有关物质含量均小于0.2%,有0.25%,可见采用本法检测灵敏度显著提高,能有关物质总量均小于0.4%。结果见表2效测定样V凵中国煤化工CNMHG中国医药工业杂志 Chinese Journal of pharmaceuticals2014,45(l)盐酸决奈达隆中甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯的GC-MS法测定丁逸梅,吴娟,陆春晓,崔萍,王德才(1.南京工业大学江苏省药物研究所,江苏南京210009:2.南京工业大学药学院,江苏南京211816)摘要:建立了气相色谱-质谱法同时测定盐酸决奈达隆中的甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯。采用TR-5MS毛细管柱,载气为氦气,电子轰击离子化(ED)离子源、正离子模式检测。甲磺酸甲酯和甲磺酸乙酯在0.7~10μgm范围内线性关系良好,平均回收率为9421%和9535%,RSD为3.79%和267%关键词:盐酸决奈达隆:甲磺酸甲酯:甲磺酸乙酯:气相色谱-质谱:测定中图分类号:O65771:TQ46072文献标志码:A文章编号:1001-8255(2014)1-1069-03Determination of Methylmesy late and ethy mesylate inDronedarone Hydrochloride by GC-MsDING Yimei", wU Juan, LU Chunxiao, CUI Ping", WANG Decai(1. Jiangsu Provincial Institute of Materia! Medica, Nanjing Tech University, Nanjing 210009:2. School of Pharmaceutical Sciences, Nanjing Tech University, Nanjing 211816ABSTRACT: A GC-MS method was established for the determination of methylmesylate(MMS)and ethyl-mesylate(EMS)in dronedarone hydrochloride. A TR- 5MS capillary column was used, with helium as the carrier gasElectron impact ionization (EI)source was employed and two analytes were detected under the positive ion mode. Thcalibration curves of MMS and EMS were linear in the range of 0.7-10 ug/mL. Their average recoveries were 94.21%and 95.35%, with RSDs of 3. 79% and 2.67%, respectively.Key Words: dronedarone hydrochloride; methylmesylate; ethylmesylate; GC-MS; determination盐酸决奈达隆(1)是由法国 Sanofi- Aventis公于2009年7月在美国上市。笔者曾对该药物进司开发的抗心律失常药,其片剂(商品名 Multaq3)行了有关物质研究(2),本试验主要研究本品在合成收稿日期:2014-05-14过程中可能产生的基因毒性杂质。1的合成工艺中作者简介:丁逸梅(1974-),女,副研究员,从事药品质量标准最后一步反应是甲磺酰化(35,甲磺酰氯可能与甲研究醇或乙醇反应生成副产物甲磺酸甲酯(MMS)或甲Tel:013851670425E-mail:jsyws@njtech,edu.cn磺酸乙酯(EMS)。甲磺酸酯属基因毒性杂质,限哈吼吼嗡吼吼吼吼吼嗡吼吼嗡吼吼吼嗡吼吼嗡吼峒吼吼峒吼吼吼峒吼嗡吼吼嗡嗡参考文献:[J.有机化学,2012,32(10):179218021]陈宏,张克英.生物素的免疫功能研究进展[J].饲料与5]刘美星,孙武军,莫一平.一种催化脱双苄合成d生物素畜牧,2008,(9):42-44的方法:中国,102786531A[P].2012-11-21[2]张旭晖,王恬.生物素营养生理作用及其应用研究进展6]陈建辉,潘一斌,陈斌.d生物素有关物质的HPLC测定[J.中国饲料,2010,(8):5-8「J.中国医药工业杂志,2009,40(5):368-373] Corey EJ, Mehrotra mm. A simple and enantioselective[7]杜碧堂,刘丽芳.注射用水溶性维生素中生物素含量测定synthesis of (+)-biotin [J]. Tetrahedron Leff, 1988, 29(1)方法改进[J.临床合理用药杂志,2010,(2):11-1357-60[8]中华人民共且中华人民共和国卫生中国煤化工[4]钟铮,武雪芬,陈芬儿.(+)-生物素全合成研究新进展部药品CNMHG