萘普生/聚乙二醇-聚谷氨酸苄酯共聚物纳米胶束

第24卷第1期中山大学学报(医学科学版)Vol.24 No.12003年 1月JOURNAL SUN YAT SEN UNIVERSITY ( MEDICAL SCIENCES)Jan. 2003萘普生/聚乙二醇-聚谷氨酸苄酯共聚物纳米胶束潘仕荣,冯敏(中山大学附属第一医院心血管研究室,广东广州510080)滴要:[目的]研究萘普生( naproxen )聚乙二醇聚谷氨酸苄酯共聚物( PEG- PBLG纳米胶束的制备、形态和体外释药规律。[方法]合成了PEG- PBLG两亲嵌段共聚物;采用透析法制备了萘普生/PEG-PBLG载药胶束通过透射电镜观察、动态光散射测定、紫外吸光度测定等手段分析胶束的微观形态、粒径大小和载药量、测定了载药胶束的体外释药速率。[结果]萘普生/PEG PBLG载药胶束粒径在30~ 245 nm范围胶束呈核壳型结构PEG-PBLG胶束可大大增溶疏水性药物萘普生/PEG- PBLG胶束具有缓释作用萘普生的体外释放速率大小主要由介质的pH值决定,也受胶束粒径的影响。[结论] PEG- PBLG载药胶束是一种缓释性 能良好、有应用前景的纳米胶束。关键词:聚乙二醇聚谷氨酸苄酯共聚物;核壳型纳米胶束;萘普生;体外释药中图分类号:R944.9文献标识码:A文章编号: 1000 - 257X( 2003 )1- 0052 -06Naproxen/ Poly( Ethylene Glycol )Poly( Benzyl L -Glutamate ) BlockCopolymer Nano-MicellesPAN Shi-rong , FENG Min( Cardiovascular Rescerch Laboratory , The First Afiliated Hospital SUN Yat-sen University , Guangzhou 510080 , China )Abstract :[Objective ] To study the preparation of Naproxen/ poly( ethylene glycol )-poly( benzylL- glutamate ) copolymer micelles ,their morphology and drug release characteristics in vitro. [ Meth-ods] The poly( ethylene glycol )poly( benzyl glutamate ) amphipathic copolymers were synthesized ，Naproxen/ PEG PBLG copolymer micelles were prepared by dialysis method. Microscopic morphology，diameter and drug- loaded amount of the micelles were examined by means of TEM ,DLS and UV re-spectively , and their in vitro drug release rates were measured. [ Results] The diameters of micelles .were in the range of 35 ~ 245 nm , and the core-shell structure existed in the micelles , PEG- PBLGcopolymer micelles could solubilize hydrophobic drugs. In vitro Naproxen sustained release from mi-celles was observed. [ Conclusion] Drug/PEG-PBLG copolymer micelles display perfect drug -releaseperformance and can be potentially used as a new nano- pharmaceutical carrier.Key words : poly( ethelene glycol )-poly( benzyl glutamate ) copolymers ; core-shell type nano mi-celles ; drug-delivery system ; naproxen ; in vitro sustained drug- release[J SUN Yat-sen Uni( Med Sci),2003 24( 1):52-57 ]由亲水嵌段与疏水嵌段组成的两亲型AB嵌这种新型的纳米释药系统受到了国内外学者们的段共聚物在水溶液能够形成球状胶束其疏水嵌重视1~3。聚乙二醇( PEG )是无毒和非致免疫的段构，成胶束的芯而亲水嵌段构成水合性外壳胶亲水性聚合物具有良好的生物相容性,它常被用束直径在纳米级范围。疏水嵌段组成的芯可以用作蛋白质的修饰以减少抗原性或被用作药物微球作微药库,由于大多数药物是疏水性的,它们可以表面中国煤化工收41。聚a氨基酸是通过化学键合或物理包埋方式结合到胶束的芯内，结Mh. CNMH G类生物材料主链上众收稿日期2002-05 - 08基金项目广东省科委科研攻关基金资助项目( 9622020 -01 )作者简乔瘤径楚1944- )男广东广州人研究员博士生导师;冯敏(1974- )女现为新加坡南洋理工大学博士后.第1期潘仕荣等.萘普生/聚乙二醇_聚谷氨酸苄酯共聚物纳米胶束多的肽键在体内蛋白酶作用下极容易断裂降解生( BI200SM美国布鲁克海文公司)测定胶束的粒成无毒的小分子具有良好的生物相容性和生物降径7。标准曲线的测定萘普生样品适量用DMF解性。聚谷氨酸苄酯PBLG )是其中一种在缓释制溶解制成质量浓度为0.040mg/mL的溶液。用剂中使用较多的疏水性氨基酸均聚物。萘普生化Hitatch-2000U型双光束分光光度计在240 ~ 400学名为d-2( 6-甲氧基-2'-萘基)丙酸[ d-2( 6-nm之间扫描331 nm吸收峰灵敏度高,干扰小选methoxy-2'-naphthyl ) propioric acid] ,是芳香丙酸331 nm为检测波长。精密称取萘普生40 mg ,用类非甾体消炎镇痛药。为改善病人服药的顺应性DMF溶解并稀释到100 mL为贮备液。用移液管和安全性国内外先后开发了萘普生控释片、液体移取0.5 1.0 2.04.08.0 ,10.0 mL贮备液置于缓释制剂和肠溶制剂但尚未见有萘普生纳米胶束25 mL容量瓶中,用DMF定容至刻度。使用75-2的报道。纳米胶束研究选择萘普生作模型药物对紫外分光光度计(UV)在331nm处测定各溶液的其他药物亦有参考意义。本文合成了聚乙二醇_聚吸光度拟合标准曲线公式为d naproxen )( g/L)谷氨酸苄酯(PEG-PBLG)两亲嵌段共聚物,由此制=0.1402 A -0.000 96( n=6,r=0.999 8%胶备了萘普生( naproxen )共聚物载药胶束,并研究束的载药量测定:定量的载药胶束干品置入透析了该载药胶束的微观形态和体外释药规律。袋密封袋外加入定量DMF.37C振荡3H(振荡器同1.5)用75-2C紫外分光光度计测定DMF液1材料与方法在331 nm处吸光度,由上述标准曲线计算载药量。1.5萘普生的增溶性试验1.1主要试剂定义投药量D=萘普生/(聚合物+萘普生)xNaproxer(浙江仙居制药股份有限公司批号100%选D分别为5%、10%、20%、30%、40%、98021 )透析袋( SMI公司孔径:数均相对分子质50%和60%,总投料量为20mg,制备萘普生/量Mr≤3500 ),a-甲氧基、w~氨基~聚乙二醇PEG-PBLG胶束,PEG- PBLG的数均相对分子质量( MeO-PEG-NH2 )由实验室自制5],三光气(固体，M, ,分别选用7.8x10*、9.9X103与15.2X 103 ,上海化工专科学校实验化工厂》其它试剂为市售胶束溶液离心除去未包埋药物。按1.4方法测定分析纯所有溶剂使用前须经蒸镏处理。载药量求最大增溶量。1.2 PEG-PBLG 嵌段共聚物的制备1.6萘普生 胶束的体外释药试验谷氨酸在浓硫酸催化下先进行γ_苄酯化、再标准曲线的测定:精密称取萘普生25 mg ,用与三光气作用制备谷氨酸酯羧酸酐最后在MeO-0.1mol/LNaOH溶解并稀释到100mL为贮备PEG-NH2引发下聚合生成PEG-PBLG嵌段共聚液用移液管移取0.1 0.5 ,1.0,1.5 2.0 3.0 mL物6]。由核磁共振法( MNR )测定PEG/PBLG两贮备液置于25 mL容量瓶中用蒸馏水稀释至刻度嵌段的物质的量比值并计算PBLG嵌段以及共聚制备成1~30mg/L系列浓度溶液用紫外分光光度计在331 nm处测定各溶液的吸光度拟合标准物的数均相对分子质量M, n。曲线方程为:p( naproxen )( mg/L) = 150.0A1.3 Naproxen/ PEG-PBLG载药胶束的制备称取定重和定配比的PEG- PBLG与naproxen42.41( n=6 r=0.999 8%溶解于N ,N-二甲基甲酰胺( DMF )中然后转移至透析袋倒入定量的萘普生胶束溶液并密封透透析袋内置蒸馏水中透析在2 h.5h8h和12 h析袋放入含50 mL释药介质的锥形瓶内释药介质分别替换新鲜蒸馏水24 h后将透析袋内胶束溶液分别为:①HCl溶液( pH=1.1 )②邻苯二甲酸氢钾离心除去未包埋药物上清液经0.45μm滤膜过缓冲溶液(pH=4.0);③磷酸盐缓冲溶液(pH=.溶彩+1= 10)锥形瓶放在的滤4C保存胶束溶液,或冷冻干燥后得胶束干中国煤化1自制二图( 94士4 )beat/min温品28]。MHCNMHG度保.1_1儿。心时以详并更换新鲜介质用1.4 萘普生胶束的的表征胶束的形态和粒径分析:在Philips CM10透射75-2C紫外分光光度计测定样品在331nm处吸光电镜SEM)上观察胶束的微观形态3]使用动态光度按上述标准曲线方程计算释药量。散射( dyh荔熱据ght scatter ,DLS )粒子分析仪54中山大学学报(医学科学版)第24卷2.3共 聚物载药胶束的粒径大小及其分布2结果M77和M79是使用同一种PEG-PBLG共聚物数均相对分子质量为7.8x 103 )并在相同的制2.1 PEG- PBLG嵌段共聚物的数均相对分子质量备条件下得到的共聚物胶束,所不同的是M77不在PEG-PBLG的聚合反应中,PBLG 聚合度和载药(透析前共聚物的DMF溶液不加入萘普生其共聚物数均相对分子质量M,都随反应开始时的单它操作同载药胶束) ,M79则含萘普生13.7%(表体/引发剂质量比摩尔数比)的变化而改变(表1)2)图2为使用动态光散射法所测定的这两种共聚物胶束的粒径及其分布图。用作体外释药试验表1单体/引发 剂质量比、PBLG聚合度和共聚物数等研究的共聚物胶束的载药量与粒径数据列于表均相对分子质量M,n2。载药量主要由萘普生的投料量决定,PEG-Table 1 Anhydridd monomer ) initiator amount of substancePBLG的数均相对分子质量也有影响,详见图3。ratid nλ/n; ) in moles .degree of polymerization ofM89的PEG-PBLG数均相对分子质量最大，粒径PBLQ DPpBLG; ) and number -average relative molec-也最大达245nm;M79数均相对分子质量最小,ular mass of copolymer( M)粒径最小，仅35.7 nm ;M30、M40的数均相对分子nμ/n1DPpLGMrm质量中等粒径也处中等在126~ 128 nm之间。12.5/110.2x 10325/13111.8X 103100-50/11715.2X 10375/15920.1X 103100/17822.1X 103重50150/123.6X 103DP : degree of polymerization5.050.0 500.0 .5.050.0 500.02.2共聚物载药胶束的微观形态d/ nm图1透射电镜照片清晰地表明了胶束的核-图2使用DLS法测得共聚物胶束的粒径及其分布壳型结构疏水性的PBLG不能被磷钨酸染色,在( X轴为对数刻度)电镜视野下呈亮白色的内核,亲水性的PEG虽然Fig.2 Diameter and distribution of copolymer micelles mea-本身不被染色,但它吸附了水相中的部分磷钨酸，sured by DLS method X axis is in logarithmic scale )Left : un- loaded micell of 33.2 nm in diameter ( M77 ); Right :在电镜视野下呈灰色晕环,而电镜视野背景是磷钨drug-loaded micelX 13.7% )of 35.7 nm in diameter( M79 )酸溶液相,干燥后不透电子束,呈现暗黑色背景。计算出胶束直径约220 nm内核直径约180 nm外表2共聚物/ 萘普生载药胶束的粒径和载药量壳厚度约20 nm。Table2 Diameter and drug _loaded amount of naproxen/copolymer micellesDrug- loadedMicelles No.d/nmamount( % )M309.9x 10311.0128M4023.8126M777.8x 103033.213.735.7中国煤化工200nm16.6245FYHCNMHG图1空载载药胶束的透射电镜照片2.4萘 普生的增溶性评价Fig.1 TEM photogragh of un-loaded copolymer micelles将载药量对投药量D作图(图3)投药量增( copolymer ME 15.2x 103 ,micelles stained by 1 % phospho-atungstic acid'第1期潘仕荣等.萘普生/聚乙二醇聚谷氨酸苄酯共聚物纳米胶束Men=7 800加时胶束中药含量随之增加当萘普生投药量增- rMrn=9 900加到一定值时胶束中载药量达到最大值,此值即-0-Mr.n=15 200胶束的最大增溶量。萘普生在共聚物胶束中增溶量的数据见表3 ,萘普生在胶束中的增溶量比在水中的溶解度大得多随着共聚物数均相对分子质量的增大其胶束的增溶效果也越见增强;另一方面0t随着透释介质pH值的减小其增溶效果也现增强。2.5不同条件 下载药胶束的体外释药速率20D/ %06(2.5.1在不同 pH值的释药介质中释药图4表图3投药量D对不同相对分子量共聚物胶束载药量的影响明在不同pH介质中,M40载药胶束释药初期都(pH=6.3)会出现突释相随后释药速率逐渐减慢,进入一个Fig.3 The effect of drug-feeded amount D on drug- loaded较长的缓释期。萘普生在pH= 1.1的介质中释药amount of copolymer micalles with different relative速率最小在中性或碱性介质中释药速率加快在molecular mass at pH= 6.3pH= 10.0的介质中释药速率最大。表3萘普生在不同pH水中的溶解度及在不同数均相对分子质量共聚物胶束中的增溶量Table 3 Solubility of naproxen in water at different pH and naproxen- solubilized amount in PEG PBLGmicelles with different relative molecular mass 1s( naproxen )Naproxen- solubilized amount / ( mg/L)pH/( mg/L)2)M,n=7.8X 103Mrn=9.9X 103M,n= 15.2x 1036.381.41852713451.111.12553434141)d copolymer micelles )= 1 g/L ;2)The s( naproxen )V( me/L ) was solubility of naproxen in water at 25 C100.0 r一+■pH1.1.。pH4.0.nm和245nm两者间相差由1~7倍。图5表明一pH7. 4●. pH10. 0了载药胶束的粒径大小对释药速率的影响96 h后80.0.-.■M79胶束的药物累积释放量为M89胶束的1.260.040.0"3讨论20. 03.1决定 PEG-PBLG嵌段共聚物的数均相对分子质量的因素0.0PEG-PBLG嵌段共聚物的数均相对分子质量40508(t/h是决定胶束能否生成、粒径大小的重要因素。本研究采用a-甲氧基、w氨基聚乙二醇作为聚合反应.图4M40胶束(粒径126nm)在不同pH介质的释药曲线的引发剂由干PFG的数均相对分子质量已选用Fig.4 In vitro drug-released curves of M40 micell in50dYH中国煤化工分子质量的大小取决different pH media于1CNMHGG嵌段的长短又受单体/引发剂的物质的量比( n/nγ )影响。由表1可2.5.2不 同粒径载药胶束的释药M79、 M30、以看到,当nλ/n1增大时,PBLG嵌段的聚合度M89的载药量分别为11.0%、 13.7%和16.6%大DPpBuc随之增大。n/n1 比值越大即引发剂的相小在同一数童敬范围,但粒径分别为35.7 nm 12856中山大学学报(医学科学版)第24卷70nm时微球在体内就会不易被识别9。本文制备的胶束外层PEG的厚度已达20 nm ,所以能减少迟60血液中巨噬细胞对纳米微球的摄取延长胶束在血50 t2液中的半衰期有利于制成长循环的纳米胶束。3.3影 响共聚物载药胶束的粒径大小的因素PEG-PBLG共聚物载药胶束溶液为无色半透& 30一一35.7 nm(M79)明溶液,用DLS法测得的各种胶束的粒径在35~20口128 nm(M30)245nm范围,分布较窄。共聚物中的疏水嵌段越长其形成胶束的粒径就越大(表2)制备溶剂对莫104-r245nm(M89)胶束的粒径也有很大影响采用数均相对分子质量为7.8X 103的共聚物制备胶束,在其它制备条件247:9相同时,由纯DMF制备的胶束粒径较大(106t/h图5不同粒径胶束的释药曲线(介质为pH=7.4nm )而由纯四氢呋喃( THF )制备的胶束粒径很小磷酸盐缓冲溶液)(78nm),但选用DMF/THF混合比例为55/45时Fig.5 In vitro drug- released curves of micelles with differ-制备的胶束粒径最大( 215 nm)共聚物/ 溶剂比越ent diameter in pH= 7.4 phosphate buffer solution大制得的胶束粒径就越大。图2表明，载药胶束M79的粒径为35.7 nm空载胶束M77的粒径为对用量越少生成的活性中心越少,链增长反应得33.2 nm可见对同一共聚物和相同制备条件的胶到PBLG嵌段较长的共聚物6。束来说载药胶束的粒径比空载胶束的粒径略有增.3.2共聚物载药胶束的制备加粒度分布范围也稍为变宽以上结果与Sung等PEG-PBLG的亲水嵌段和疏水嵌段大小必须的报道是相近的8]。有适当比例,才能生成热力学稳定的核壳型结构,3.4共聚物胶束对萘普生的增溶性文献报道制备胶束的两亲共聚物数均相对分子质数均相对分子质量为7.8x 103、9.9x 103与量都在12x 103~18X 103之间78。若亲水嵌段15.2X 103的PEG-PBLG中疏水嵌段数均相对分太大,疏水嵌段太小,PEG-PBLG就会变成水溶性子质量分别是2.8x 103、4.9x103和10.2x 103分子胶束难以生成若疏水嵌段太大亲水嵌段太其胶束对萘普生增溶量分别是萘普生在pH=6.3小则形成芯核直径很大外壳很薄的结构体系极水中溶解度的2.2.3.3和4.2倍(表3),可见不稳定会导致沉淀产生7。我们的实验表明,当PEG-PBLG胶束增溶能力随疏水嵌段的长度增加PEG嵌段的数均相对分子质量固定为5x 103时,而增强。因为随着疏水嵌段链长增加胶束的内核PEG-PBLG数均相对分子质量大到19X10时胶直径也增加,包埋药物的容量也随之增加。在pH束开始伴有少量沉淀, 随着数均相对分子质量继=1.1的酸性溶液中,以上3种胶束对萘普生增溶续增大沉淀物就越来越多所以制备胶束的PEG-量分别是萘普生原药在水中溶解度的23、41和PBLG的数均相对分子质量应该在20x103以下为37.5倍,PEGPBLG胶束增溶能力随透析介质的宜。pH值降低而增强。由于萘普生分子内含有一个羧PEG-PBLG是两亲型嵌段共聚物,而萘普生在基pH值降低不利于羧基的电离,引起在酸性水中水中几乎不溶。透析法是共聚物和药物分子溶解、的溶解度下降但却更有利于以未离解分子的形式分散和缔合水分子和溶剂分子在透析膜两边的相被PBLG疏水链所包埋形成药含量更大的内核。互渗透共聚物分子自发两亲平衡的过程,最后药3.5_影响载药胶束的体外释药速率的因素物被包埋在核内生成核-壳型结构的载药纳米胶3MH中国煤化工释药速率越大在束这是载药胶束具有热力学稳定性的原因。有学CNMH&内的萘普生呈未解离者认为药物/两亲共聚物胶束是- -种自组装系统状态释放速率较慢在碱性条件下萘普生的羧基( self- assembling system58。巨噬细胞对纳米微球会发生电离形成离子态在水中溶解度增大,内核摄取量的减少与其表面PEG层的厚度有关。文献表皮的萘普生首先离子化释放芯核内部的药物也报道,直径存敌据的微球表面PEG层的厚度为10不断离子化向芯核表面迁移释放速率要比酸性和第1期潘仕荣等.萘普生/聚乙二醇聚谷氨酸苄酯共聚物纳米胶束中性条件加快。碱性越强离子化速度越快释放lease from core-shell type nanoparticles in vitro[ J]. J越快。Control Rel , 199851( 2-3 ):169.3.5.2 载药胶束粒径越大,释药速率越小 根据[3] YuBG , Okano T , Kataoka K ,et al. Polymeric mi-Hguchi方程10] :dm/dt=0.5 S[2DC,C/ t]/2 ,celles for drug delivery : solubilization and haemolytic ac-tivity of amphotericinHJ] J Control Rel ,1998 ,53( 1-在其他变量相同的情况下释药速率与胶束的表面3): 131.积成正比即粒径越大者释药越慢。我们实验结果[ 4]Desai N P , HubbellJ A. Solution technique to incopo-与Hguchi方程是一致的 ,M79粒径最小释药速率rate polyethylene oxide and other water-soluble polymers最快;M30粒径中等，释药速率适中、M89粒径最into surfaces of polymeric biomaterials[ J ] Biomaterials ，大释药速率最慢。1991 ,12X2):144.以两亲共聚物PEG-PBLG为载体,用透析法[5]Johann L , Jan C , Joke V ,et al . Facile methods for the可制备PEG- PBLG/萘普生载药胶束。胶束粒径在introduction of an a- -amino end-group[ J ]. Makromol35~ 245 nm范围胶束呈核~核壳型结构,PEG-Chem Rapid Commun,1991 12 1-2 ):159.PBLG胶束可大大增溶药物特别是疏水性药物如[6]潘仕荣黄宁芳周群等.聚a~谷氨酸r-苄酯合成的改进J].生物医学工程学杂志,1990 X4 )321.萘普生。PEG-PBLG/萘普生胶束具有缓释作用,[7]Jiahorng L, Takao A , Kazunori K ,et al. Visualization释放介质的pH值对萘普生的释放有较大影响释.of PEO-PBLA Pyrene polymeric micelles by atomic force放速率随pH值增加而明显加快粒径对药物的释microscop[J] Pharm Res , 1998 ,15 11):1721.放也有-定影响。[ 8 ]Sung B L, Teruo O , Kazunori K. Preparation and char-(在使用动态光散射法测定胶束粒径的工作中得到暨acterization of the micell forming polymeric drug in-南大学生物医学工程所王耀熊教授和屠美副教授的无私帮domethacin- incorporated poly( ethelene oxide )-poly( β-助特此致谢)benzyl L aspartiate ) block copolymer micelles[ J ]. J参考文献:Pharm Sci ,1996 ,85 1 ):85.[9]赵锦花.新型药物载体一-PEG修饰聚氰基丙烯酸纳[1 ] Kataoka K , Matsumoto T , Yokoyama M ,et al. Dox-米微球的制备及其性能研究[ D]天津大学,2001.orubicin- loaded poly( ethylene glycol )paly( β-benzy)-L-58.aspartate ) copolymer micelles : their pharmaceutical[ 10]奚念朱.控速释药体系和缓释制剂J].药学学报,characteristics and biological significanceC J ]. J Control1984 ,1X9)715.Rel ,2000 64( 1-3):143.[2]Jong Y 1 ,CheonJ B , Kim S H ,et al. Clonazepam re-(编辑刘清海)(上接第51页from page51)[3] Piao Y S, Peltoketo H, Oikarinen J. 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