玉米秸秆生物炼制燃料乙醇的研究

第31卷第6期林产化学与工业Vol 31 No 62011年12月Chemistry and Industry of Forest ProductsDec 2011玉米秸秆生物炼制燃料乙醇的研究朱均均,陈尚钘2,勇强!,徐勇,陈牧,余世袁(1.南京林业大学化学工程学院;林木遣传与生物技术省部共建教育部重点实验室;江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室,江苏南京21007;2.江西农业大学林学院,江西南昌30045)摘要:以玉米秸秆为原料,研究了中酸预处理条件下水洗得到的残渣经酶水解后进行己糖发酵、水洗液经三烷基胺萃取脱毒后进行戊糖发酵的乙醇得率,并对整个工艺进行了物料衡算。结果ZHU Jun-jun表明:中酸预处理的最佳条件为温度100℃,硫酸质量分数3%,时间12h。残渣的酶水解液浓缩至葡萄糖质量浓度为138.72g/L进行乙醇发酵,在24h时糖利用率为99.02%,此时乙醇质量浓度达到最高为62.98g/L,是乙醇理论得率的89.90%。水洗液经过三烷基胺萃取脱毒后,乙酸、5-羟甲基糠醛和糠醛的去除率分别为72.73%、42.86%和100%;水洗液经浓縮、脱毒后的脱毒液(含有7.80g/L葡萄糖和52.80gL木糖)的乙醇发酵能力大大提高,在48h时糖利用率为93.17%,此时乙醇质量浓度达到最高为21.76g/L,是乙醇理论得率的8234%。经物料衡算,生产1t乙醇需要6.8t绝干玉米秸秆。该工艺为实现己糖和戊糖分开发酵的工业化提供参考依据。关键词:玉米秸秆;预处理;酶解;脱毒;乙醇发酵中图分类号:TQ353.4文献标识码:A文章编号:0253-2417(2011)06-0035-06Biorefinery of Corn Stover for Fuel EthanolZHU Jun-jun, CHEN Shang-xing2, YONG Qiang, XU Yong,CHEN Mu,YU Shi-yuanMinistry of Education; Jiangsu Key Lab of Biomass-based Green Fuel& Chemicals, Nanjing 210037 Chiny y(1. College of Chemical Engineering, Nanjing Forestry University; Key Laboratory of Forest Genetics Biotechnology2. College of Forestry, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)Abstract: Corn stover was pretreated by moderate acid and then washed by water. The solid residue after filtration was hydrolyzat-ed to monosaccharide with cellulase for further fermentation to ethanol, while the liquid fraction after filtration was detoxified withtrialkylamine extraction to ferment to ethanol. The material balance was carried out in the whole process. The results showed thatthe optimal pretreatment conditions were temperature 100 C, sulfuric acid mass fraction 3 and time 12 h. After 24 h fermen-tation of the condensed enzymatic hydrolyzate containing 138. 72 g/L of glucose, the sugar utilization rate was 99. 02 and theethanol mass concentration reached its peak value of 62.98 g/L, which corresponded to 89 90 of the theoretical value. Pre-hydrolyzate was detoxified by trialkylamine extraction, 72. 73 of acetic acid, 42. 86 of 5-hydroxymethylfurfural and 100%furfural could be removed. The fermentability of the detoxified prehydrolyzate was significantly improved. After 48 h fermentationof the detoxificated prehydrolyzate containing 7. 80 g/L of glucose and 52. 80 g/L of xylose, the sugar utilization rate was93.17 %, and the ethanol concentration reached its peak value of 21.76 g/L, which corresponded to 82. 34 of the theoreticalvalue. After materials balance, it required 6. 8 t absolutely dry com stover to produce one ton ethanol. The process of this studyprovided the reference to realize the industrialization of hexose and pentose fermentation separately.Key words: corn stover; pretreatment; enzymatic hydrolysis; detoxification; ethanol fermentation乙醇是一种可再生的生物基含氧燃料,其生产原料主要有淀粉糖类和木质纤维类。以淀粉为原料生产乙醇存在与民争粮等缺点受到限制而被叫停,而以木质纤维为原料因其具有含量丰富、价格低廉等而得到广泛研究。木质纤维原料包括纤维素、半纤维素和木质素通过对其进行预处理、酶水解后将纤中国煤化工收稿日期:2011-06-20基金项目:国家林业局林业公益性行业科研专项(201004001);江苏高校科技创新THCNMHG优势学科建设工程资助项目(无编号作者简介:朱均均(1979-),男江苏如舉人,讲师博士,主要从事生物质资源生物转化的研究。林产化学与工业第31卷维素和半纤维素转化为可发酵性糖用于发酵生产乙醇3。预处理是木质纤维原料生物转化的第一步也是最为关键的一步,一个好的预处理方法不仅能够具有较高的糖得率,还应尽可能降低抑制物的产生。预处理方法有物理法化学法、生物法和结合法等,而预处理后产生的抑制物主要有弱酸类呋喃类及酚类化合物类,其中弱酸类中的甲酸和乙酸是影响树干毕赤酵母发酵的主要抑制物6。笔者通过对玉米秸秆进行中酸预处理研究,旨在将己糖和戊糖分开发酵。研究了不同的预处理条件,预处理渣酶水解液的乙醇发酵,水洗液的脱毒、乙醇发酵及整个工艺的物料衡箅,以期为工业化生产实现已糖和戊糖分开发酵提供基础数据和参考。材料与方法1.1玉米秸秆中酸预处理玉米秸秆收集于内蒙古呼和浩特市,其主要成分纤维素、半纤维的质量分数分别为373%、19.2%。一定质量的玉米秸秆(0.180-0.425mm)在质量分数2%-4%的硫酸中浸泡过夜(固液比为1:15,g:mL),将酸液抽滤出,滤出的酸液回用于下一轮。滤渣稍微研磨后装入封闭容器中,放入90110℃烘箱中保温8-12h,取出,用一定体积的60℃左右水洗涤(以起始原料为基准,固液比为1:10,g:mL)、抽滤3次,并用旋转蒸发仪(水浴温度70℃,真空压力17kPa)将滤液浓缩至木糖质量浓度为50g/L左右,此时得到的滤液即为玉米秸秆预水解液。分别收集滤液和滤渣,备用。1.2玉米秸秆预处理渣的酶水解称取相当于2.0g的绝干预处理玉米秸秆渣于50mL三角瓶中,加入1mo/L柠檬酸缓冲溶液1mL,再加人酶用量为15FPIU/g(以纤维素计,下同)的纤维素酶液,用水定容至20mL,充分搅拌均匀封口后,置于50℃、振幅80的恒温水浴中酶解48h。反应结束后于3000r/min下离心10min,取上清液稀释后采用HPLC测定糖的组成及浓度。13玉米秸秆预水解液的脱毒玉米秸秆预水解液采用三烷基萃取法进行脱毒,具体方法如下:移取一定体积的玉米秸秆预水解液于三角瓶中,按水油相比1:2(体积比,下同)加入一定比例的萃取剂(三烷基胺-正辛醇-煤油,体积比3:5:2),用封口膜封口后放入摇床中(温度25℃、转速200r/min)反应60min后取出,在5000r/min下离心5min,得到的下层水相即为脱毒液。1.4乙醇发酵1.4.1菌种己糖发酵酵母:酿酒酵母(Sα ccharomyces cerevisiae)N22;戊糖发酵酵母:树干毕赤酵母( Pichia stipitis)NLP31,均保藏于南京林业大学生物化工研究所,保存在4℃琼脂糖斜面上。1.4.2培养基斜面培养基(g/L):葡萄糖/木糖20,琼脂20,蛋白胨5,酵母浸膏3;活化及增殖培养基(g/L):葡萄糖/木糖20,蛋白胨5,酵母浸膏3,用蒸馏水配制;酶解液发酵培养基(g/L):一定浓度酶水解糖液(以葡萄糖计),CaCl20.20,MgSO40.08,znCl20.08,尿素0.24,加人酸或碱调节pH值为5.66.0;脱毒液发酵培养基(每升含量):一定量浓度脱毒液,(NH4)2SO45g,KH2PO43g,MgSO4·7H2O0.5g,EDTA30mg,ZnsO4·7H209mg,MnCl2·2H2O2mg,CoCl2·6H200.6mg,CuSO4·5H200.6mg,Na2MoO4·H2O0.8mg,CaCl2·2H2O9mg,FeSO4·7H2O6mg,H3BO32mg,KI0.2mg。用pH值5.4的柠檬酸缓冲液配制。1.4.3发酵条件酿酒酵母(树干毕赤酵母)活化及增殖培养条件:温度30℃,转速150r/min(170r/min)。当酵母增殖几轮后,将离心后的酵母转入发酵培养基进行发酵,发酵条件为:温度30℃转速150r/min1.5分析方法中国煤化工1.5.1原料分析原料中纤维素、戊聚糖和木质素含量的分析按道CNMHG斤81.5.2糖、乙醇及抑制物定量分析糖(纤维二糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖)、乙醇、抑制物(甲酸、乙酸、乙酰丙酸、5-羟甲基糠醛和糠醛)定量分析在美国 Agilent I00型高效液相色谱仪上进行。采用朱均均,等:玉米秸秆生物炼制燃料乙醇的研充Bio- Rad HPX-87H柱(78mm×300mm),柱温55℃,流动相5mmo/L的硫酸流速0.6mL/min,上样量10μL,示差折光检测器。外标法测定。计算方法:糖利用率表示消耗糖的质量浓度与发酵初始糖的质量浓度的百分比。乙醇得率是指生成的乙醇质量浓度与发酵中消耗糖的质量浓度分别乘以转换系数后的百分比,理论上1g葡萄糖得到0.51g乙醇而1g木糖得到0.46g乙醇。2结果与讨论2.1玉米秸秆中酸预处理在前期预处理实验的基础上,选取温度、硫酸质量分数和时间作为影响因素,旨在得出最适宜的中酸预处理条件,设计了一个3因素3水平的正交试验(L34)对预处理的主要影响因素进行进一步优化。玉米秸秆经过中酸预处理后,用蒸馏水洗涤,洗涤后的固体渣经纤维素酶水解,采用HPLC测糖浓度,而水洗液也采用HPLC测糖和主要的抑制物的浓度,正交试验的设计及结果如表1所示。表1正交试验设计及结果Table 1 The factors and levels of the orthogonal design温度/℃硫酸质量分数/%时间/h总糖/%1)抑制物 inhibitor/%temperatureH SO, mass fractionotal sugar甲酸 formic acid乙酸 acetic acid39.00.3543.00.41100.310.360.425.7243.60.5l11011044.86.9537.43339.13342.96742.30344.00043.76743.6335.4344.500总糖是指100g玉米秸秆预处理渣酶水解后的还原糖与玉米秸秆预处理后水洗液中还原糖之和,还原糖包括纤维二糖葡萄糖、木糖和阿拉伯糖 Total sugars refers to the sum of reducing sugars from the enzymatic hydrolysis of the 100 g pretreated com stover and reducing sug-from the hydrolyzate after water-washing pretreated com stover. Reducing sugar contains cellobiose, glucose, xylose and arabino以总糖为考察指标,根据表1计算极差(R)值大小分析可知,影响总糖含量的因素从大到小依次为:温度、硫酸质量分数时间。并推算出当温度110℃,硫酸质量分数4%,时间10h时,总糖得率最高(4.8%),也即为表1中9号实验。但从表1中总糖结果可知,5号实验结果与9号实验结果相差不大,可以通过延长时间来降低温度和硫酸质量分数。另外,从表1中主要抑制物甲酸和乙酸的含量也可知提高温度会增加抑制物的生成,不利于后续的乙醇发酵。因此,综合考虑总糖、抑制物及成本等因素,确定温度100℃,硫酸质量分数3%,时间12h作为玉米秸秆中酸预处理的最适宜条件。2.2玉米秸秆预处理渣酶解后的乙醇发酵玉米秸秆经过最适宜条件的中酸预处理后,水洗得到的残渣用纤维素酶水解成单糖(主要为葡萄糖)后可用酿酒酵母进行发酵。当葡萄糖质量浓度很低(10g/L)时,其消耗速度与糖质量浓度成直线关系,但当葡萄糖质量浓度达到150g/L以上时,它对酵母的发酵和呼吸作用都产生抑制作用,主要是因为高葡萄糖浓度会导致高渗透压和低水活性!。因此,本研究将得到的酶水解液用旋转蒸发仪(70℃,17kPa)浓缩至葡萄糖质量浓度为150g/L左右用于发酵V凵中国煤化工示。从图1中可以看出,随着发酵时间的延长,葡萄糖的利用呈现CNMHG趋势从发酵0h的138.72g/L下降到24h的1.36gL,而乙醇质量浓度则随着葡萄糖的不断消耗而呈现先快速增加后趋于平缓的趋势,在发酵24h的乙醇质量浓度达到6298g/L,此时的糖利用率和乙醇得率分别林产化学与工业第31卷达到9.02%和89.90%。这说明S. cerevisiae nl22能够在150葡萄糖质量浓度为150g/L的酶水解中达到较高的乙醇得率120和糖利用率,这为燃料乙醇的工业化生产提供可靠的依据。2.3玉米秸秆预水解液的脱毒玉米秸秆预水解液与三烷基胺萃取剂以水油相比1:2加入三角瓶中混合后置于摇床中,在25℃、200r/min下进行:3010脱毒反应60min,反应结束后离心,取出下层水相采用HPLC进行分析。玉米秸秆预水解液脱毒前后成分分析如表2812162024时间h所示。o一乙醇 ethanol:-△-葡萄糖 glucose从表2中可以看出,玉米秸秆预水解液经过三烷基胺萃图1玉米秸秆预处理渣酶解液酿酒酵母取脱毒后,糖(纤维二糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖)的浓度没NI22乙醇发酵的历程有降低反而升高,这可能是因为在萃取的过程中,有部分水ig. 1 The time course of ethanol fermenta也被萃取到有机相中。而抑制物质量浓度均有不同程度的tion of the enzymatic hydrolyzate下降,糠醛、乙酸、甲酸、乙酰丙酸和5-羟甲基糠醛分别下降from moderate acid pretreated com了100%、72.73%、61.29%、43.90%和42.86%。这说stover by S. cerevisiae NL22明三烷基胺萃取脱毒是一种有效的脱毒方法,其去除抑制物的能力高,并且不损失糖是选择其脱毒的重要原因21表2玉米秸秆预水解液脱毒前后的组成分析Table 2 Component analyses of com stover prehydrolyzate before and after detoxification成分脱毒前质浓度/(gL)脱毒后质量浓度/(gL1)mass concentration before detoxificationnass concentration after detoxification纤维二糖 cellobiose3.62葡萄糖euco7.18木糖 xylose54.83阿拉伯糖 arabinose8.57甲酸 formic0.31乙酸 acetic acid3.74乙酰丙酸 levulinic acid5-羟甲基糠醛5- hydroxymethylfurfural0.14糠醛 furfural0.032.4‘玉米秸秆预水解液脱毒后的乙醇发酵玉米秸秆预水解液经过三烷基萃取后的脱毒液(含有780g/L葡萄糖和52.80g/L木糖),采用经驯化的树干毕赤酵母P. stipitis NLP31进行乙醇发酵,其发酵产物乙醇质量浓度糖利用率和乙醇得率如表3所示。表3玉米秸秆中酸预水解液脱毒后的乙醇发酵Table 3 Ethanol fermentation of detoxificated prehydrolyzate of corn stover时间/h乙醇质量浓度/(gL1)糖利用率/%乙醇得率/%17.7121.7622.00凵中国煤化工CNMHG从表3中可以看出,随着发酵时间的延长,乙醇浓度呈现先快速上升后趋于平缓的趋势。在发酵48h时,乙醇质量浓度达到21.76g/L,此时的糖利用率和乙醇得率分别为93.17%和82.34%;当发酵第6期朱均均等:玉米秸秆生物炼制燃料乙醇的研究时间延长至60h时,乙醇质量浓度略有增加,此时的糖利用率有所提高,增加到98.93%,但乙醇得率却有所下降降低到7847%。而未脱毒的水洗液乙醇发酵基本上不能发酵(数据未列出),这说明水洗液经过三烷基胺萃取脱毒后,其乙醇发酵能力大大增强,这有利于戊糖发酵生成乙醇。2.5物料衡算玉米秸秆经过中酸预处理、酶水解、水洗液脱毒以及戊糖、己糖分开发酵制备乙醇的工艺进行物料衡算,并根据每一步液体的体积将质量浓度数据转换为绝对质量。其物料衡算如下图所示。玉米秸秤(00e绝干)一-中酸预处理}水洗一过滤滤液脱毒戊糖发酵→乙醇葡萄糖(24g)木糖(66g)(73g)滤渣酶水解己糖发酵一乙醇葡萄糖(163g木糖(L7g5g)从物料衡算结果可以得出,I00g绝干的玉米秸秆最终可以得到14.8g乙醇,折算成It乙醇需要6.8t绝干的玉米秸秆。一般认为生产It乙醇需要6-7t绝干玉米秸秆,而据报道,理论上1t乙醇只需要26t玉米秸秆,与理论相比还有很大的差距,主要原因是可用于乙醇发酵的葡萄糖含量低(100g绝干玉米秸秆酶水解只得到16.3g葡萄糖)。2.6讨论本工艺虽然实现戊糖和己糖分开发酵但存在着纤维素酶水解得率偏低的特点,主要原因是:1)纤维素酶是本实验室利用里氏木霉以纸浆为碳源所产酶,存在B-葡萄糖苷酶酶活力偏低的特点,导致在纤维素酶水解过程中存在纤维二糖对纤维素酶组分的反馈抑制作用(纤维二糖的抑制作用要强于葡萄糖)1;2)纤维素酶的用量低酶解时间短;3)中酸预处理条件弱,玉米秸秆的化学结构破坏程度较低导致纤维素对酶的可及度低,可通过与其他方法,如机械磨浆法相结合,进一步打开纤维原料的结构,从而增加单位原料的糖得率。3结论3.1玉米秸秆中酸预处理的最佳条件为温度100℃,硫酸质量分数3%,时间12h3.2玉米秸秆预处理渣经过酶水解、浓缩后的糖液乙醇发酵能力在24h达到最高,乙醇质量浓度、糖利用率和乙醇得率分别为6298g/L、902%和89.90%3.3玉米秸秆预水解液经三烷基胺脱毒浓编后的脱毒液乙醇发酵能力在48h达到最高,乙醇质量浓度糖利用率和乙醇得率分别为2176g/L、93.17%和82.34%。3.4玉米秸秆以本工艺制备乙醇,1t乙醇需要6.8t绝干玉米秸秆。参考文献[I]HENDRIKS A T W M, ZEEMAN G Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass[J]. 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