羊栖菜乙醇提取物的抗氧化活性

第50卷第22期湖北农业科学2011年11月Hubei Agricultural SciencesNov. 2011羊栖莱乙醇提取物的抗氧化活性叶红1,周春宏2,高蓓蕾2,王晓晴1,曾晓雄',杨效华,任德康1(1.南京农业大学食品科技学院,南京21095;2江苏省环境监测中心,南京210036)摘要:用体积分数70%的乙醇浸提羊栖菜( Sargassum fus forme)得到粗提物,将粗提物溶于去离子水再依次用有机溶剂萃取,得到氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃取后剩余物,測定粗提物和各萃取物的总多酚含量、维生素C和维生素E含量以及还原力。结果表明,正丁醇萃取物中的总多酚和维生素E含量较高,正丁醇萃取物和乙酸乙酯萃取物具有较强的还原力关键词:羊栖菜( Sargassum fusiforme);抗氧化活性;总多酚;DPH中图分类号:Q9492885;R2842文献标识码:A文章编号:0439-8114(201122-4695-03Antioxidant Activities in Vitro of Ethanol Extract from Sargassum fusiformeYE Hong, ZHOU Chun-hong GAO Bei-lei, WANG Xiao-qing, ZENG Xiao-xiong, YANG Xiao-hua, REN De-kang'(1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agriculture University, Nanjing 210095, China2 Jiangsu Environmental Monitoring Center, Nanjing 210036, China)Abstract: Crude extract (CE) of Sargassum fusiforme was obtained using 70% ethanol as extracting solvent, dissolved indistilled water and then fractionated by inorganic solution including chloroform (Cf), ethyl acetate (EtOAc), and n-butanoln-BuOH)orderly; Four fractions of Cf, EtOAc, n-BuOH and aqueous were collected. The antioxidant activities and con-tents of total polyphenols, vitamin C and E in CE and the four fractions were determined. Results showed that contents oftotal polyphenols and vitamin E were higher in n-BuOH fraction; While n-BuOH fraction and EtOAc fraction exhibited higher antioxidant activItyKey words: Sargassum fusiforme; antioxidant activity; total polyphenol; DPPH羊栖菜( Sargassum fusiforme)属褐藻门马尾藻抗氧化活性进行系统分析,可为羊栖菜的综合利用科,是暖温带-亚热带性海藻,主要生长在太平洋北提供理论依据。部,在我国广大海域都能生长。酚类化合物广泛存在于此类植物中,具有多种保健功能,其中最重要材料与方法的是抗氧化功能。它不仅对活性氧自由基具有很强1.1材料的捕捉能力,而且可以对由氧自由基诱发的生物大羊栖菜:购于山东威海青正食品有限公司分子损伤起到保护作用,具有明显的抗突变、抗肿试剂:DPPH·(1,1-二苯基苦基苯肼)购于美国瘤、抗病毒、抗微生物、抗衰老等功能1。关于海藻Siga公司, Folin- Denis试剂、维生素C(VC)和维生中水、醇或脂溶性溶剂提取物的抗氧化活性报道甚素E(VE)试剂盒购于南京建成生物工程研究所,其多。研究表明褐藻多酚具有很强的自由基清除能余试剂均为国产分析纯。力,是一类在药学、食品和日化等领域很有使用前试验仪器:植物粉碎机(荷兰 Philip公司),电子景的天然抗氧化剂和自由基清除剂8。国内有关羊天平BS210s(北京塞多利斯仪器系统有限公司),数栖菜中的多酚和抗氧化活性的研究较少。因此,以显恒温水浴锅HH-6(常州国华电器有限公司),旋羊栖菜为原料,对其萃取物总多酚、维生素含量及转蒸发仪(德国 Heidolph公司),台式离心机Anke收稿日期:2011-03-21基金项目:南京农业大学青年科技创新基金(Y200415)作者简介:叶红(1975-),女,江苏南京人,副教授,博士,主要从事生物物质分离及分析的研究,(电话)13645170320(电子信箱)4696湖北农业科学011年TDL-5(上海安亭科学仪器厂),722S可见分光光度阳性对照。同时作样品空白试验,即将0.1mL样液计(上海精密科学仪器有限公司),冷冻干燥机与3.0mL无水乙醇混合,按上述条件进行同样的操ALPHA1-2(德国 Martin christ公司)。作,测定517mm处的吸光度A20对DPH清除率的1.2方法计算公式:清除率=[1-(A1-A2)Ab]×100%。1.2.1羊栖莱粗提物和各萃取物的制备取羊梄1.2.5HO2清除率的测定取不同浓度样品溶液菜200g,清水洗净剪碎,在30℃烘箱中烘干,用植1.0mL于试管中,分别加入2.4mL磷酸盐缓冲液物粉碎机打成粉末,用2L70%(体积分数,下同)的(0.mol/,pH74)和06mLHO2溶液(40mmo/),乙醇浸提。离心后取上清液,真空浓缩,冻干得粗提混匀,反应10min后,测230m处的吸光度A1,以物,将粗提物溶于去离子水,再依次用氯仿、乙酸乙VC作阳性对照。以去离子水代替样液,按上述条件酯、正丁醇萃取,浓缩冻干,分别得到氯仿萃取物、进行同样的操作,测230m处的吸光度A,同时做乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃取后剩余物,样品空白试验,即以去离子水代替HO2溶液,按上流程见图述条件进行同样的操作,测230mm处的吸光度A2。以去离子水代替样液和HO2溶液,做参比试验调零羊栖菜70%乙醇浸提用。对HO2清除率的计算公式:清除率=[Aa-(AA2)]/A100%。1:1(体积比)氯仿萃取3次1.2.6还原力的测定取不同浓度样品溶液1.0mnL于试管中,分别加入1.0mL磷酸盐缓冲液(0.2氯仿萃取物1:1(体积比)乙酸乙酯mol/L,pH6.6)和1.0mLKe(CN)6溶液(0.03mol/L),混匀,50℃水浴20min,取出后迅速冷却,加10mL三氯乙酸溶液(0.6mol/L),混匀,再加0.2乙酸乙酯萃取物1:1(体积比)正丁醇萃取3次mL Fecl3溶液(6mmol/L),混匀,10min后于700nm处测其吸光度A1,以VC作阳性对照。同时做样品空白试验,以去离子水代替FeCl3溶液,于700mm正丁醇萃取物萃取后剩余物处测其吸光度A2。以去离子水代替样液和FeCl3溶图1羊栖菜粗提物和各萃取物的制备流程液做参比试验调零用。以吸光度(A1-A2)表示样品的1.2.2总多酚含量的测定( Folin- Denis法)标准还原力。吸光度越大,表明还原力越强。曲线的制作:称取25.0mg间苯三酚,用去离子水完全溶解,定容至25mL容量瓶中配制成浓度为102结果与分析g/m的间苯三酚溶液,分别取0、0.050.150.25、21羊栖菜粗提物及各萃取物的得率0.35、045mL间苯三酚溶液,加去离子水稀释至7羊栖菜经70%乙醇浸提后得到粗提物,粗提物mnL混合均匀,加入 I mL Folin- Denis试剂摇匀,3依次用不同有机溶剂萃取后得到氯仿萃取物、乙酸后加入2mL0.7moL的Na2CO3溶液,混合充乙酯萃取物、正丁醇萃取物及萃取后剩余物,将其分测定710m处吸光度,以吸光度为纵坐标,间苯浓缩冻干,粗提物及各萃取物的得率(质量比)、总三酚浓度为横坐标作图,得标准曲线。样品总多酚多酚含量、VC和VE含量见表1。由表1可知,氯仿含量的测定:将粗提物和各萃取物配成适当浓度的萃取物和萃取后剩余物的得率较高,而乙酸乙酯萃溶液,按上述步骤操作,测定η10m处吸光度,样品取物和正丁醇萃取物的得率较低。正丁醇萃取物的中总多酚含量以每克干重含有的间苯三酚含量表总多酚含量较高,乙酸乙酯萃取物、粗提物和萃取示,单位是mg/go后剩余物中的总多酚含量较接近,氯仿萃取物中的1.2.3VC和VE含量的测定(啡罗啉法)粗提物总多酚含量较低。萃取后剩余物中的VC较高,各萃和各萃取物中ⅤC和ⅤE的含量使用试剂盒测定取物的VE含量为:正丁醇萃取物>萃取后剩余物>1.2.4DPPH·清除率的测定将O.1mL无水乙醇乙酸乙酯萃取物>氯仿萃取物>粗提物。与3 mL DPPH·无水乙醇溶液(1×10-mol/L)混合,2.2DPPH的清除率摇匀,以无水乙醇调零,测517mm处的吸光度AoDPPH·是一种稳定的自由基,广泛用于评价抗再将01mL样品溶液(稀释至不同浓度)与3mL氧化物质的清除自由基活性。DPH·具有单电子DPPH·无水乙醇溶液混合,摇匀,30℃暗处反应30在517mm处有强吸收(呈深紫色),当有自由基清除min,测517m处的吸光度A,以绿原酸(CHA)作剂存在时,自由基清除剂与其单电子配对而使其光第22期叶红等:羊栖菜乙醇提取物的抗氧化活性4697表1羊栖菜粗提物及各萃取物的得率、总多酚含量一氯仿萃取物C和VE含量丁醇提取物得率(质量比)总多酚含量VC含量VE含量粗提物样品←萃取后剩余物*一乙酸乙酯萃取物粗提物8.003.80氯仿萃取物30.3714317.50480乙酸乙酯萃取物1.0正丁醇萃取物浓度/mg/mL萃取后剩余物21.2114.06.20图3粗提物及各萃取物对HO2的清除率吸收逐渐消失,其退色程度与其所接受的电子数成乙酸乙酯萃取物正丁醇提取物定量关系,因而可用分光光度法进行定量分析。粗一粗提物提物及各萃取物对DPPH的清除率见图2氯仿萃取物一萃取后剩余物由图2可见,正丁醇萃取物和乙酸乙酯萃取物在低浓度时对DPPH…的清除率较高,而氯仿萃取物和萃取后剩余物对DPPH·的清除率较低。粗提物和00.51.01.5各萃取物的清除率均随着浓度的增加而增加。特别浓度/mg/mL图4粗提物及各萃取物的还原力是粗提物对DPPH·的清除率随浓度的变化较明显阳性对照绿原酸在浓度为0.1mg/mL时对DPH·物>萃取后剩余物>氯仿萃取物。粗提物及各萃取物清除率为29.81%。的还原力均随着浓度的增加而提高,而氯仿萃取物的还原力随样品浓度的增加时变化较小。阳性对照2s0粗提物丁醇萃取物VC在浓度为8共g/m时Amom为0.364萃取后剩余物氯仿萃取物3小结乙酸乙酯萃取物1)羊栖菜的氯仿萃取物和萃取后剩余物的得率较高,而乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的得率01.0较低。正丁醇萃取物中总多酚含量较高,为26.38浓度/mgm图2粗提物及各萃取物对DPPH的清除率mg/g,正丁醇萃取物中VE含量最高,萃取后剩余物中ⅤC含量最高。23H2O2的清除率2)测定了羊栖菜粗提物和各萃取物的还原力,HO,在230m处有最大吸光度,若与样品反结果表明正丁醇萃取物具有较好的清除DPH·的应,其吸光度将会降低,因此其吸光度越低,表明样能力和清除HO2的能力,乙酸乙酯萃取物的还原力品清除HO2的能力越强。粗提物及各萃取物对较强。正丁醇萃取物和乙酸乙酯萃取物的还原力较HO2的清除率见图3。由图3可见,在浓度大于0.5强,这可能与萃取物中含有较多的活性总多酚有关。g/m时,正丁醇萃取物对HO2的清除率最高,其参考文献:次是氯仿萃取物,萃取后剩余物和乙酸乙酯萃取物世界科技研究与发展,2005,27(5):56-63对HO2的清除率较低。粗提物及各萃取物对HO2[2]魏玉西,郭道森,牛锡珍,等.褐藻中多酚化合物的研究进展[J]的清除率随浓度的变化不太明显。阳性对照VC在(31图惠成,张高的利用与开发1食品科技,986浓度为05mg/m时对HO2的清除率为92%。4还原力的测定[4] ALBERTUS J S. Medicinal and pharmaceutical uses of seaweedatural products: A review [J]. Journal of Applied Phycology还原力测定的原理即样品能将赤血盐[KFe2004,16(4):245-262(CN)6还原成黄血盐[KFe(CN)6],黄血盐再与Fe2[5]李伟,张应团.火棘多酚类物质的体外抗氧化作用[J].食品作用生成普鲁士蓝,在700m波长测定吸光度,以61石碧狄莹植物多酚N2,北京,科学出版社.0检测普鲁士蓝的生成量,Amm越高,表示样品还原水生生物学报,1999,23(5):494499力越强。图4显示了粗提物及各萃取物的还原力。[8]魏玉西,于曙光.两种褐藻乙醇提取物的抗氧化活性研究海洋科学,2002,26(9):49-51由图4可见,在相同浓度时,粗提物及各萃取物的91严小军.中国常见褐藻的多酚含量测定[J.海洋科学集刊,还原力为:乙酸乙酯萃取物>粗提物>正丁醇萃取1996,37(10):61-65