橡实制备燃料乙醇菌种筛选及工艺考察

安徽农业科学, Joumal of Anhui agri.Sci.2012,40(34):16722-16724赉任编辑宋平责任校对况玲玲橡实制备燃料乙醇菌种筛选及工艺考察赵晓锋!,张全2,姚秀清},王钟熠!,佟明友2(1.辽宁石油化工大学,辽宁抚顺11301;2抚顺石油化工研究院,辽宁抚顺113001)摘要〔目的]筛选适宜的橡实制备燃料乙醇的箇种,并优化该发酵冮芑。[方法]以樟实粉为原料,筛选适宜的燃料乙醇发酵菌株,并对该工艺条件进行了优化。[结果]酿酒酵母FE-B是一株高效的耐受单宁中温菌株。以橡实粉制备燃料乙醇,当液化温度为95℃,乳液浓度为32%,液化pH为5.8,液化酶用量0.·6%,糖化酶用量0.05%,发酵温度为36℃时,可获得较高产率的燃料乙醇。[结论]在纤维乙醇生产技术尚不成熱的前提条件下,为了发展非粮燃料乙醇,利用野生淀粉资源橡实发酵生产燃料乙醇是一种很好的选择。关键词橡实;燃料乙醇;酿酒酵母;工艺中图分类号S216文献标识码A文章编号0517-6611(2012)34-16722-03Screening of the Strain for Acorn Producing Fuel Ethanol and Fermentation Process OptimizationZHAO Xiao-feng et al University of Liaoning Petroleum and Chemical Technology, Fushun, Liaoning 113001)Abstract [Objective] The research aimed to screen suitable strain for acorn producing fuel ethanol and optimize the fermentation processMethod] Acorn powder as material, suitable strain for producing fuel ethanol was screened, and the process condition was optimized. Re-sult] Saccharomyces cerevisiae FE-B was an efficient mid-temperature strain with tannin tolerance. Acom powder as material to produce fuelethanol, when liquefaction temperature was 95 C, emulsion concentration was 32%, liquefaction pH was 5.8, liquifying enzyme amount was0. 06%, glucoamylase amount was 0. 05%, fermentation temperature was 36C, we could obtain high-yield fuel ethanol. Conclusion]Un-der the premise that cellulosic ethanol production technology was not mature, to develop non-grain fuel ethanol, it was a good selection for u-sing acorn to produce fuel ethanolKey words Acom; Fuel ethanol; S. cerevisiae; Process燃料乙醇指作为燃料添加到汽油中的乙醇,可部分替121℃灭菌20mn,冷却至60℃左右时,加入0.05g/L的代石油,缓解石油资源短缺。燃料乙醇既是一种清洁能源,TrC,备用。中温(40℃)酵母菌筛选平板(HRS):双层培又是一种良好的汽油增氧剂和辛烷值调和组分,用以代替四养基平板底层为YPD固体培养基,上层为TC培养基乙基铅和甲基叔丁基醚(MIBE)或乙基叔丁基醚(ETBE)21。1.2仪器设备高效液相色谱、H-601超级恒温水浴、从生物质光合作用、生物质制燃料乙醇到乙醇燃烧的过程,D25W电动搅拌器、双层玻璃反应器(1、2L)、SBA生物传在自然界形成了CO2的闭合循环,可缓解地球的温室效应,感器。燃料乙醇还可降低汽车尾气污染,因而燃料乙醇具有重要的1.3橡实燃料乙醇制备工艺橡实仁→粉碎→单宁提取生态、环保意义。汽油中乙醇的体积分数低于10%-15%→调配乳液→液化→糖化→发酵→蒸馏→燃料乙醇。时,不仅不需对现有汽车发动机进行改进,且汽油还具有辛1.4分析方法烷值高和抗爆性好的优点3,因而燃料乙醇已在世界许多1.4.1葡萄糖浓度和乙醇浓度的测定。采用液相色谱法国家广泛应用推广力度不断加大。发展燃料乙醇的关键是色谱条件:采用糖柱,超纯水为流动相流速0.5m/mn,柱实现非粮酒精的规模化,降低生产成本温65℃,检测器温度40℃。橡实是壳斗科( Fagaceae)植物种仁的总称。我国橡1.42基因测序。委托上海生工生物工程技术服务有限公实资源丰富,品种繁多,年产橡实大约为6×10~7×10kg,司( Sangon)。且橡实中含有大量的淀粉。橡实虽然营养丰富,但可食用1,4.3菌株种属检测。委托中国微生物菌种保藏管理委员性差是重要的潜在淀粉。利用橡实为原料制备燃料乙醇则会普通微生物中心( CGMCC)是一条很好的途径,对维护国家粮食安全有重大的意义1.5菌种筛选方法样品采集→富集培养→耐受中温驯1材料与方法1,1试验材料橡实粉来自抚顺金宇食品有限公司收购的化→梯度稀释、涂布平板、培养→挑选单菌落、斜面纯种培养→摇瓶发酵筛选→获得中温酿酒酵母→耐受单宁驯化→梯橡实仁,磨浆,沉淀,洗涤,干燥,最后得到橡实淀粉;菌种是酿度稀释、平板分离培养→挑选单菌落斜面纯种培养→摇瓶酒酵母 Saccharomyces cerevisiae FE-B;液化酶为耐高温a-淀粉酶 Liquozyme Supra2.2x;糖化酶为β-淀粉酶 Suhong gA475。发酵筛选→获得耐受单宁的高效中温酿酒酵母。YPD培养基:蛋白胨2%,酵母膏1%,葡萄糖2%,pH1.5.1平板分离初筛。稀释40℃条件下多次驯化的米酒6.0(固体培养基加琼脂1.5%~2.0%),121℃灭菌20min酒曲培养物,YPD固体平板上涂布,40℃静置培养48h后,备用。T℃C培养基:葡萄糖0.5g,琼脂1.5g,水100ml将TTC上层平板培养基(冷却到45℃)倾倒于YPD固体培养基表面厚度幼然后皆干40℃保温,比较菌落颜色深浅,将所作者商介土结(3=),男,古林白山△,项士研究生,研究方向:复筛中国煤化工培养基中进行CNMHG收稿日期201209-11L.5.2摇瓶发酵复筛。将初筛平板上挑选的菌落共50个40卷34期赵晓锋等橡实制备燃料乙醇菌种筛选及工艺考察16723分别转接到葡萄糖发酵培养基摇瓶中,40℃兼气发酵培养。FE-B酵母菌,发酵48h。测试料液不同浓度对橡实淀粉发测定发酵液中的残糖和乙醇浓度,筛选乙醇浓度高,残糖少酵乙醇的影响结果见图2。从图2可知,发酵48h后,发酵的菌株转接斜面,4℃冰箱保存备用。。液中的残糖浓度分别为0.2%、0.2%和0.3%,乙醇浓度分别2结果与分析为6.0%75%和9.0%。可见,经过48h发酵后,体系中的21菌种分离筛选及鉴定取摇瓶筛选的中温釀酒酵母葡萄糖基本上消耗完毕,产生的乙醇浓度随着橡实粉乳液浓接入到含有0.125g/L橡实栲胶的YPD培养基中,40℃培度的增大而增大。但乙醇单耗随橡实粉乳液浓度的增加呈养24h,再取该培养液Iml转接到新鲜的含0.250g/L橡实上升趋势,橡实粉乳液浓度为24%、32%和40%的条件下,单栲胶的YPD培养基中,40℃培养24h。逐步提高YPD中橡耗分别为3.683.%和4.16t橡实粉/t乙醇。从橡实淀粉的实栲胶的浓度到1.000g/L,每24小时接种传代一次,40℃利用率考虑,24%橡实粉乳液浓度单耗最低,但是再考虑到培养,驯化中温酿酒酵母耐受单宁的能力。经过若千代驯化发酵液中最终乙醇的浓度越低,后续分离提浓乙醇所需要的后,选择生长旺盛、产气丰富的酵母菌培养物进行梯度稀释,能耗越高,因此从乙醇单耗和发酵液乙醇浓度综合考虑,橡涂布分离平板进行分离纯化,挑取在平板上生长快速的单菌实粉乳液的浓度为32%比较合适。落,利用摇瓶进行复筛,最后筛选获得一株高效的耐受单宁中温酿酒酵母F-B。通过对FE-B菌株的生理生化分析以及26 S rDNA D/D2基因测序,与 Genbank上的相关基因进行比对分析,确定FE-B的种属名为酿酒酵母。2.2橡实粉粘度特性考察考察了橡实粉的乳液的粘度随温度的变化曲线。取10g橡实粉(≤100目),加入100ml自来水,配制成橡实粉乳液,缓慢加热,随时记录乳液的粘度值,如图1所示。从图1可知,温度在80℃以下,橡实粉乳液的粘度值变化不大,基本保持在比较恒定的值(4-10橡实乳液度%mPa·s);80℃开始,粘度值开始急剧上升,峰值温度范围在图2不同橡实粉乳液浓度体系精化液发酵乙醇和残糖含量80.0-91.5℃,最大值为40mPa·s,随后开始下降。这一现25液化pH对橡实淀粉发酵乙醇的影响利用100ml三象与赵文恩等报道的橡实淀粉乳液粘度峰值温度范围约为角瓶作为反应器配制32%的橡实粉乳液(橡实粉初始含水85~90℃近似”。同时,考虑到液化酶的酶解温度范围,因量10.1%)液化酶用量0.06%,液化时间2h,液化温度95此在橡实淀粉制备燃料乙醇工艺中,其液化温度为95℃。℃,糖化pH4.5,糖化酶用量0.05%,糖化时间64h,糖化温度58℃,1~4号试验液化pH分别为525.5、5.8和6.0。糖化液经过EE-B发酵48h。测试不同液化pH对橡实淀粉发酵乙醇的影响,结果见图3。从图3可知,32%的橡实粉乳液在pH分别为5.25558和6.0条件下进行液化,然后糖化糖化液经过FE-B发酵48h,生成的乙醇浓度分别为7.5%7.0%75%和75%。除了pH为55产生的乙醇浓度稍低,其余3个pH条件产生的乙醇浓度相同。可见,液化pH对最终乙醇发酵的产率影响不大,不过为了发挥液化温度℃酶的最大效率液化pH保持在58比较合适。图1橡实粉的粘度特性2.3单宁对FE-B发酵产乙醇的影响以过夜培养的FEB培养物为种子,接种到5个装有100ml葡萄糖发酵培养基的250ml三角瓶中,接种量为1%。5个三角瓶中分别加7.3入橡实栲胶(含单宁50%以上)0、0.125、0.2500.500和1.000g/L,36℃培养产乙醇。48h后,采用SBA生物传感器7.1测定发酵液中的乙醇浓度。结果表明,0.125-1.000g/L的橡实栲胶对F-B发酵生产乙醇没有影响,经过48h发酵发酵液中的乙醇浓度与对照体系(不加橡实栲胶)相同,都为图3橡实粉乳液不同pH条件下液化对最终发酵产乙醇的影响7%(w/)。2.6橡实淀粉化_田是的定利用100ml2.4料液浓度对橡实淀粉发酵乙醇的影响利用100三角瓶作为反中国煤化(橡实粉初始含三角瓶作为反应器,分别配制24%、32%和40%的橡实粉乳水量10.1%),CNMH化温度95℃,糖液(橡实粉初始含水量10.1%),经双酶法液化糖化后,接入化条件和“2.5”中的相同,1-3号试验液化酶的加入量分别16724安徽农业科学2012年为0.04%0.06%和0.08%。糖化液中分别接入FE-B酵28不同温度对FE-B生产乙醇的影响以过夜培养的母菌,置于30℃条件静置发酵48h,测定发酵液中的乙醇浓FE-B培养物为种子,接种到4个装有3L葡萄糖发酵培养度,见图4。从图4可知,发酵48h后,生成的乙醇浓度分别基的5L发酵罐中,接种量为1%。分别于28、3642和48℃为7.0%、7.5%和7.5‰%。体系的最终乙醇产生量随液化酶培养产乙醇,定期采用液相色谱法测定培养液中的残糖、乙的加入量呈上升趋势,酶加入量增加到0.06%时,乙醇产生醇和乙酸,如图6所示。从图6可知,FE-B在28、36和42量趋于稳定;液化酶加入量为0.06%和0.08%时,发酵液中℃发酵24h,发酵液中的乙醇浓度分别为8.0%、8.1%和的乙醇浓度都为7.5%。为了降低液化酶的使用成本,在橡3.3%;48℃条件下不能发酵产生乙醇。因此,发酵温度为实粉乳液中加人0.06%的液化酶比较合适。36℃比较合适。8.7.56求=恻如尔0.0n35化酶加入量∥%温度H℃图4橡实粉乳液中加入不同液化酶量对最终发酵产乙醇的影响图6F-B在不同温度培养24h后葡萄糖、乙醇和乙酸浓度27糖化酶用量对橡实酒精发酵的影响取已经液化的3结论液化乳液330g,分装到5个250ml三角瓶中,糖化酶用量分通过对F-B菌株的生理生化分析,确定FE-B是一别为0.03%、0.05%、0.08%、0.10%、0.12%,糖化pH4.5,株高效的耐受单宁中温酿酒酵母。以橡实粉制备燃料酒精,糖化时间64h,糖化温度58℃。糖化64h后,分析糖化液中当液化温度为95℃,乳液浓度为32%,液化pH为5.8,液化葡萄糖浓度,见图5。葡萄糖浓度越高,乙醇产率也随之升酶用量0.06%,糖化酶用量0.05%,发酵温度为36℃时,获高。从图5可知,酶加入量为0.05%时,糖化液的葡萄糖浓得的燃料乙醇产率较高。在纤维乙醇生产技术尚不成熟的度达到最高,为15%,因此,在橡实乳液中加入0.05%的糖化前提条件下,为了发展非粮燃料乙醇,利用野生淀粉资源橡酶比较合适。实发酵生成燃料乙醇是一种很好的选择。参考文献[1] DANIEL HUNTV The gasohol handbook[M]. New York: Industrial Press-lnc,198l:497-513[2]邢展.乙醇汽气油的应用现状[J].河北化工,201,34(3):7-72[3]孙远涛朱荣福乙醇汽油对发动机性能影响的实验研究[J].价值工程,2010(6):79[4]邢启明,孙启忠高凤芹苜蓿生产燃料乙醇研究[JOL].hp:/wwdocs. com75403501556.htm[5]陈辉,陆善祥生物质制燃料乙醇[.石油化工,200(2):l07-11[6]胡芳名,李建安湖南省主要橡子资源综合开发利用的研究[J].中南05015[刀]谢碧鰻,谢涛我国橡实资源的开发利用[J]中南林学院学报,200,9(3):37-42.酶加入量%[8]王娜娜姚秀凊,张全酸酒酵母FE-B的分离筛选及应用研J].应用化工,2011(7):1215-1218图5糖化酶加入量对酶解生成葡萄糖的影响[9]赵文恩,韩雅珊,邵德益,等橡子利用的研究()——橡实淀粉的特性[J].林产化学与工业,1996(2)69-74·十“十“““““+-““+十“++(上接第16721页)若尔盖高原湿地为例].四川环境,2001,20(4):49[2]赵亚辉“中国最美的湿地草原”草场化沙化加剧EB/OL]hp:[9杨永兴若尔盖高原生态环境恶化与沼泽退化及其形成机制J山地people. com. cn/GB/14748/6155830 html学报,199,17(4):318-323.[3]田应兵若尔盖高原湿地不同生境下植被类型及其分布规律[J长江[10]九三学社四川省委关于加强西北高原生态建设的几点建议[EB大学学报:自科版,2005,2(2):1-5Ol.http://special.scol.comcn/112hui/ta/20110115/20111152244405]刘规,唐勇,方艳若尔盖温地旅游开发的环境影响及对策[]水资源邓支林,田昆,杨永兴等高原显地若尔盖国家级自然保护区景观变保护,200,23(5):82-86[6]梅燕若尔盖高原湿地生态旅游资源保护性开发研究[]]中国人口[12]李晟之小规模保护区旅游开发的选择——王朗自然保护区对生态资源与环境,x003,13(6):60-61旅游的探素村经济201)41-43「7雍国玮石承苍鹏飞川西北高原若尔盖草地沙化及湿地萎缩动态[3]连干銮生态中国煤化工明等自然保护区的实遥感监测[]山地学报,2003,21(6):70-761跋谈起四[8]刘海张军西部湿地资源现状、问题及可持续发展研究——以四川省CNMHG°2(1):5-