发酵工艺放大的优化

2003年第26卷第2期发酵工艺放大的优化T46瘸要发醇工艺的优化有多种目的,通过优化以期增加成品的产量,但优化过程必须蓬循药品生产质量管理规范GMP)原则、有效利用现有的设备并符合预期的最终生产规模。经基因修饰超量产生重组蛋白的徽生物具有优势,绝大多数工艺仅采用三类菌种,即大肠杆菌、酿酒酵母和巴氏毕赤酵母。本文概括了作者为保证生物制药发酵工艺放大方法的有效性所设计的一些基本原关键词优化发酵工艺表达放大在项目可行性策略分析中包括发酵工艺组成型表达还是诱导型表达。表达产物是在的优化,一旦证明所选菌种可用于生产,优化胞质区室还是分泌到外周培养液中。如果菌工作即已开始,表明已经构建出了表达系统,株是从本实验室外获得的,必须对原始菌株至少从理论上应该将表达系统枧为已优化系来源和克隆步骤的质控文件进行评估,并需统在进行漫长而又昂贵的优化工作之前,建获得具有资质的质量保证部门批准后才能使立稳定的菌株非常重要,至少需要保持从细用。胞库建立到大规模发酵(包括预培养)所需代应优化目的基因的密码子使用以促进其次的稳定。以质粒为基础的表达系统有时不在选定微生物中的表达。必须立即通过播瓶稳定,有几个参数能够影响质粒的分离不稳培养进行表达水平筛选,从而发现能够高水定性。每种质粒的稳定性各不相同,这取决于平表达重组蛋白的克隆宿主菌株,高度的不稳定性与低拷贝数质粒培养条件的优化有关。插入的DNA大小影响质粒的稳定性:优化的主要目的是尽可能地提高产量质粒越大越不稳定。培养条件(如温度、培养该过程可从实验室规模的纯化工艺开始,采基组成和生长速率等)也能改变质粒的稳定用最少量的现有质控工具来定量和评估产品性。对数生长期后期质粒丢失非常明显,基因质量。发酵程序彩响杂质类型,进而严重影响表达期间质粒的不稳定性增加,经常应用抗下游加工(DSP的功效。同样,发酵条件能够生素来稳定质粒。由质粒编码补偿宿主的营决定目的蛋白是以可溶性形式还是以不溶性养缺陷比用抗生素调节更为合适,然而营养形式存在,这进一步影响DSP和纯化产品的缺陷型菌株培养基的制备非常繁琐。插入质量和产量。在高产菌株中,超量产生也能遺parB(hok/sok)基因座可以稳定质粒,通过成某些因子耗竭,而这些因子对于维持蛋白质粒的分离能杀死丢失质粒的细胞。另一种质的良好构象是必需的。因此,发酵条件的优情况是将插入的DNA片段整合到宿主染色化必须与提纯工艺的优化同步进行,因为它体中,常见的例子是巴氏毕赤酵母构建体,但们之间彼此相互彩响。发酵工艺和DSP开发基因整合后会降低基因表达水平人员之间的交流质量是工艺放大成功的关生产菌株和表达载体的选择将取决于是键。参考文款3 Lusso P et al. Virology 2000, 273, 228-2401 Lusso p et a]. Vaccine,2002:20(15);1964-1967(2002-10-25收稿)2 Nardese V et al. Nat Struct Biol. 20011 81611-615中国煤化工CNMHG《国外医学》预防诊断治疗用生物制品分册发酵工艺的优化研究可通过每次改变如可能应尽量避免使用动物来源的原个因素、或同时改变几个参数来进行,并运用料,如必须使用,所用原料必须是在无传染性统计学分析寻找它们之间的相互作用。按统海绵状脑病(TSE)的国家生产的。计学要求设计实验是一种有组织的方法这培养液pH的优化是关键性因素,特别样每次实验获得的可靠资料要多于无计划研是对于酵母分泌蛋白,因为酵母可在很宽的究。统计资料分析可使不同实验变量之间的pH范围内生长。PH的选择取决于重组蛋白相互作用更为具体化,并可预测实验未直接表达的稳定性,在低pH培养巴氏毕赤酵母涉及的其他方面的反应数据。对工艺开发人可避免蛋白水解酶的降解作用,这种酵母在员来说,最重要的研究内容之一是确定能够pH低至2.2时不能生长影响产品产量或质量的可变因素温度对所表达蛋白的溶解性以及产量具发酵可以采用分批、补料-分批和连续培有重要作用,在甲醇诱导阶段,温度从30℃养三种方式进行。连续培养在制药工业领域降至25℃,将使克隆在巴氏毕赤酵母中的半不常用,因为采用这种方式发生突变和污染乳糖氧化酶的产量增加4倍的可能性较高,且每批的规模界限不清分批对于补料分批发酵过程,以指数形式补培养过程简单但费力;补料分批培养模式是料将使细胞以恒定生长速率生长,这对重组唯一可达到高细胞密度的培养方法,它比较蛋白的表达十分有利。如果达到高生长速率复杂,但可对菌株的代谢进行控制。对于酿酒溶解氧经常是一个限制性因素。对于甲醇营酵母,高葡萄糖浓度能诱导 Crabtree效应:养型酵母,维持细胞在呼吸代谢阶段避免培即使在不限制氧的情况下,酵母还是能进入养液中甲醇的过度积累是关键,否则会引起发酵代谢阶段。通过采用补料分批培养方式快速中毒。空气与氧气混合供给是有益的。加可以控制酵母代谢。在肉汤培养基中,限制补压可提高培养液中溶解氧的浓度,但也相应料葡萄糖的浓度,可以使酿酒酵母在呼吸代增加了溶解的二氧化碳浓度,因此或许并不谢阶段呈高密度生长,同时避免大肠杆菌产合适限制溶解氧有时对表达有益,克隆到大生乙酸盐。常通过比较每天重组蛋白的产量肠杆菌中的酶在L阿拉伯糖可诱导载体中来选择最经济的工艺过程的表达即为这种情况。当氧摄取速度最大而培养基既可以是完全确定成分培养基,溶解氧浓度为零时,立即进行重组蛋白表达也可以是含蛋白胨的综合培养基。综合培养的诱导是最合适的时机。基制备容易、廉价,并可使工程菌快速生长,影响发酵工艺放大的因素包括传代次但分析困难,且每批间易产生差异对于微生数、突变的可能性、培养液的灭菌温度和pH物的繁殖生长及上清液中分泌性蛋白的纯调节的质量、振荡通气量和压力。进行工艺度,确定成分培养基优于综合培养基。两种培放大的最好方法是首先将要达到的最终生产养基中碳源的选择至关重要,对于大肠杄菌,规模的培养条件缩小至中试规模。当扩大规高浓度葡萄糖将造成乙酸盐积累降低生物模后,培养液将变得越来越不均匀。对于大型量产量和表达水平。因此,对于大肠杆菌,选发酵罐,在反应器的某些局部区域内氧处于用甘油作为碳源比用葡萄糖好。甘油可抑制耗竭状态。巴氏毕赤酵母乙醇氧化酶启动子,Mut菌株形成的工艺必须通过某些质控部门的检诱导期间最好避免使用甘油,对于Mu菌定和验证以证明该工艺的稳定性、可靠性和株可用山梨醇代替甘油,并用混有甲醇的补可重复性所有的仪器设备必须按GMP要料-分批培养基替代求进行验证,包括安装确认、在位清洗CIP):罐:遂中国煤化工CNMHG铺》2003年第26卷第2期验证、在位灭菌(SIP)验证维护和校准方案特性的研究提示,对更多的特殊参数进行试的验证等,发酵工艺直到Ⅱ期临床阶段都可验。例如,添加辅因子或底物能够稳定酶进以改进,但必须按最终生产规模进行。而增加终产量。在这一研究领域,科学家的想异源蛋白生产的优化始于设计良好的重象力和创造力可获得超出最佳多因素实验设组菌株的构建,发酵工艺的改进策略涉及菌计所能达到的杰出成果株特性和重组蛋白性质方面的知识。发酵工(张振龙编译李津校)艺的完善要考虑来自DSP改进、最终生产规參考文献模和GMP要求的反馈信息。即使发酵工艺1 Thiry M et al. Trends Biotechnol,2002120(3):10已经尽可能地趋于标准化,但仍有研究表明即便是微小的改进也可能大大提高生产率。2 Enfors S et al. J Biotechnol, 2001: 85: 175-1853 Doig SD et al. Enzyme Microb Technol, 2001:282265-发酵工艺的最优化应该采用两个层次的方式进行,首先以本文描述的和其他合理科学的(2002-09-09收穑优化方法进行,在第二种方式中对表达蛋白免疫佐剂作用机理研究进展R31_ A中国药品生物制品检定所(100050)徐苗综述王国治审校摘要人们对佐剂的期望不仅是提高抗体的量,还在于优化抗体的质及特异性诱导有效的细胞免疫应答。随着对佐剂作用机理研究的逐渐深入,人们提出了模式织别理论等新观点。本文试对佐剂机理的研究作一概述关镳词佐剂作用机理模式识别理论髙度纯化的新型疫苗虽具良好的抗原特因子,促使Th前体细胞向Thl或Th2不同异性和低毒性,但免疫原性低,需要配合高效的亚型分化。Th1细胞可分泌干扰素的佐剂使用。经典的铝佐剂在提高抗体水平(IFN-)、白细胞介素2(IL-2)、a肿瘤坏死因和安全方面已获长期的实践证实,但其本身子(TNF-a)等介导细胞免疫,辅助特异性的一些缺陷加上对其作用机理了解较少,使IgG2a类抗体的产生;Th2细胞则分泌IL-4之很难满足新型疫苗发展的需要。因此,5、10、13,辅助1亚类和1gE的产生。对新佐剂的开发及对其作用机理的深入研究1.2抗原提呈作用势在必行。指佐剂保持抗原构象完整并提呈给适当1佐剂作用方式的初步探讨免疫效应细胞的能力。佐剂可影响APC摄取研究佐剂作用方式,有助于人们利用佐抗原和分泌L-1、诱导Thl/Th2转换、协助剂增强免疫应答、诱导机体选择性地产生特B细胞记忆和抗体亲和力成熟等异性免疫应答和减少副反应。佐剂作用方式1.3诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTL)应可概括为以下五种:答1.1免疫调节作用通过与细胞膜融合或保护抗原肽,佐剂调节细胞因子网络的能力。不同的佐可促进相应肽掺入MHCI类分子并维持二剂诱导抗原提呈细胞(APC)分泌不同的细胞者结合同时期望通过诱导IFNy和TNFait. F. 43sci-,'tmyH中国煤化工翔CNMHG