烯丙胺等离子体处理聚丙烯膜的酶固定化

厦门大学学报(自然科学版)VoL 462007年3月Journal of Xiamen University( Natural Science)lar.2007烯丙胺等离子体处理聚丙烯膜的酶固定化朱建明(厦门迈克制药有限公司,福建厦门361022)摘要:以烯丙胺等离子体对聚丙烯膜表面进行处理后,利用表面生成的氨基功能基团进行过氧化物酶的固定化,所采用的固定化方法主要有吸附法、戊二醛交联法和分子识别法.结果表明通过等离子体处理后聚丙烯膜表面的氨基基团可以有效地提高酶固定化效率,其中分子识别法可以得到具有最高酶活和酶稳定性的固定化酶膜关键词:烯丙胺等离子体;聚丙烯膜;辣根过氧化物酶;酶固定化中图分类号:TQ426.97文献标识码文章编号:0438-0479(2007)020213-04酶作为生物体内由活性细胞产生的具有催化功其挥发),在50Pa、50W的条件下处理一定时间.将能、活性可调节的蛋白质,其催化功能具有高效、功能膜继续在烯丙胺气氛中保持半小时,最后抽真空至5专一、作用条件温和等特点,被广泛应用于制药、环保、Pa,引入氮气至常压,开启等离子体发生器并取出聚食品等领域.以高分子分离膜作为载体的固定化酶膜,丙烯膜,将其分别以乙醇和水清洗多次,然后真空干可以将酶的催化功能和膜的优良分离功能有机结合,燥成为近些年来的研究热点.但是常规高分子分离1.3改性聚丙烯微孔膜的表征膜表面由于生物相容性差,在用于酶固定化时与酶蛋以 HITACHI S4500I型扫描电镜观察膜表面的白的非生物特异性相互作用通常使酶蛋白变异甚至失微观形貌紫外吸光值在 UVIKON923紫外可见光活.本文采用等离子体表面改性法,将具有氨基功能基谱仪上测定.以G2Krus接触角仪测定膜改性前后的团的烯丙胺固定到具有优异化学稳定性和机械性能的接触角以茚三酮法来确定改性后膜表面的氨基浓度,聚丙烯微孔膜表面,利用氨基的特殊作用采用不同方正辛基胺作为标准物法将过氧化物酶固定到膜上,得到了一种具有良好分4过氧化物酶在膜表面的固定化离性能和催化功能的酶膜反应器.(1)物理吸附法:4C下将膜浸入0.15mg/mL的实验部分HRP/PBS(0.1mol/L,pH7.0)中,4.5h后取出膜以2 mL PBS溶液清洗多次,并将清洗液收集.最后将1.1实验原料膜放入PBS(0.1mol/L,pH7.0)溶液中4C下保存.辣根过氧化物酶(HRP,EC1.11.1.7, Sigma),聚测试酶溶液在浸入膜前后和PBS清洗液在403nm处丙烯微孔膜( Membrana gmbh, Germany)平均孔径的吸光值用于计算固定化酶的量m,孔隙率75%烯丙胺来自 acros.PBS缓冲溶(2)戊二醛交联法:将膜剪碎后浸入10mL由液由NaH2PO4/Na2HPO4及KCl按标准配成.生物25%戊二醛、PBS(0.1mol/L,pH9.0)、乙醇按体积比素一琥珀酰亚胺( biotin succinimide)、亲和素( avidin)1:7:2构成的混合溶液,室温、磁力搅拌下反应3h.购自 Sigma.其它常规试剂均为国产分析纯产品然后将膜取出,以大量去离子水清洗,将膜小心以滤纸1.2聚丙烯微孔膜表面的等离子体处理擦干后浸入0.1mg/mL的HRP/PBS(0.1mol/L采用RF等离子体发生器(13.56MHz)将聚丙pH7.0),在4C下保持24h.最后将膜取出.以2mL烯膜固定在等离子体发生器内直径为12cm的铝电极PBS溶液清洗多次,并将清洗液收集.最后将膜放入上.两电极间距为3cm.将发生器内部抽真空至5 Pa PBs(0TH中国煤化卫4C下保存后,引入氩气并开启等离子体发生器对膜进行预处理CNMHG碎卒后漫入0.4mg/mL(50Pa,25W,5min).随后导入烯丙胺气体(低压下使生物素一琥珀酰亚胺/PBS(0.1mol/L,pH8.0)中,室温下磁力搅拌12h.然后以大量去离子水清洗膜.将收稿日期:2006-03-2膜放入1mg/mL的亲和素/PBS(0.1molL,pH7.4)Emil:右数据 a hotmail. co中,4C下反应3h然后以大量PBS(0.1mol/L,pH厦门大学学报(自然科学版)2007年7.0)溶液清洗膜.同时,向Ⅰmg/ mL HRP/PBS(0.1丙胺等离子体在5oW下处理10min,膜表面的接触mol/L,pH8.0溶液中加入大量生物素一琥珀酰亚胺角从未改性前的147°下降到82°,说明经改性后膜表室温下磁力搅拌反应3h.最后加入10mg氨基乙酸面的亲水性显著提高.膜表面氨基浓度的测试结果也使其与未反应的生物素反应以 Sephadex g25型柱说明经过烯丙胺等离子体处理后,膜表面氨基浓度可利用不同大小分子在柱中流出速度的差异对得到的溶以增大到38.20gmol/液进行分离,收集大分子量的生物素标定的酶.将上述以扫描电镜对烯丙胺等离子体处理前后聚丙烯膜经过处理的膜浸入4℃生物素标定的酶/PBS(0.1的表面形貌进行观察,结果如图1所示对于未改性聚mol/L,pH7.0)溶液中(浓度约0.3mg/mL)进行酶丙烯膜(图la),其表面存在大量微孔.经过烯丙胺等的固定化(4C,24h)离子体处理后(图1b),发现膜表面已经覆盖了一层物1.5酶活性测试质,膜表面的微孔尺寸及数量大量减少.从膜横截面的采用氨基安替比林/苯酚( amino antipyrine-phe扫描电镜图来看,经氩等离子体及50W、10min烯丙hol)法,通过对产物在505m处的紫外吸光值的变胺等离子体处理后,膜表面新引入的物质厚度可以达化速度来测定固定化酶的活性.1个酶活性单位U定到约30nm(图1c)义为室温下每分钟形成1mol的产物.比活性(spe综上所述,经过烯丙胺等离子体处理后,膜表面的cific activity./mg)定义为每mg酶所能产生的活性按触角由高度疏水性的14降低到弱亲水性的82,单位膜活性(U/g)定义为每g固定化酶膜所产生的膜表面的氨基浓度则随着等离子体处理强度的增大而活性单位固定化酶的储存稳定性(%定义为一定时述渐提高而膜表面形貌的分析也证明经过等离子体后剩余酶活与初始酶活的百分比值.处理后膜表面引入了新的物质,其厚度可以达到几十纳米.这些结果都说明经过烯丙胺等离子体处理可以2结果与讨论成功地在聚丙烯膜表面引入氨基功能基团.从而为膜表面进行酶固定化提供了多种可能2.1烯丙胺等离子体处理聚丙烯膜的表面性2.2烯丙胺等离子体处理聚丙烯膜的过氧化能表征物酶固定化经烯丙胺等离子体处理后,分别测试了膜表面的分别以物理吸附法、戊二醛交联法和分子识别法接触角及氨基浓度如表1所示,当以氩等离子体及烯将辣根过氧化物酶固定在经烯丙胺等离子体处理的聚表1烯丙胺等离子体处理前后聚丙烯膜表面的接触角及氨基浓度测试结果Tab 1 Allylamine plasma treatment on surface properties of polypropylene membranes膜等高子体条件接触角()氨基量/(mol·g1 native PP147±3.22, low levelArgon plasmat allylamine plasma(50 W, 2 min)114±4.519.32Middle levelArgon plasma t allylamine plasma(50 W,5 min)103±2.13. high levelArgon plasma +allylamine plasma(50 W, 10 min) 82+3. 038.20中国煤化工CNMH图1聚丙烯微孔膜在等离子体处理前后的扫描电镜图(a)未改性聚丙烯膜表面;(b)经氫等离子体及50W、10min烯丙胺等离子体处理后的聚丙烯膜表面c)处理后的聚丙烯膜的橫截面方数据 M photos of different polypropylene membranes第2期朱建明:烯丙胺等离子体处理聚丙烯膜的酶固定化153.03.0采用戊二醛法和基于生物素/亲和素( biotin- avidin)间immobilized amount2.51 8283 membrane activity图255相互作用的分子识别法来固定辣根过氧化物酶结果己2020分别如图3所示从图3a可以看出,与图2中的物理吸附法相比,戊二醛法能有效提高固定化酶的含量和1。酶的比活性,从而使固定化酶膜的活性得到显著提高1.0橡|10】对于氲等离子体及Wn的烯丙胺等离子体处理后的聚丙烯膜,其表面固定化酶的量为2.78mg/g比物理吸附法有大幅度的提高;固定化酶的特性活性10.0也有所提高.而且随着等离子体处理强度的增大,固定Membrane化酶量增大的效果越明显.但是,另一方面,与物理吸图2不同聚丙烯膜经物理吸附法固定化辣根过氧化物附法相比,经过戊二醛处理后,得到的固定化酶的比活酶的结果(膜的编号见表1)性并没有明显提高.对于氩等离子体及50W.10minFig 2 Results of peroxidase immobilization by physica的烯丙胺等离子体处理后的聚丙烯膜,固定化酶的比adsorption onto different membranes活性仅为0.7lU/mg,比物理吸附法得到的酶活低,这可能是由于戊二醛与酶分子上的氨基化学键合后丙烯膜表面在酶固定化过程中,酶溶液的浓度及固定使得酶的构象发生变化从而降低了活性化时间对固定效果影响较大.经测试后确定较优的固近些年来基于生物素一亲和素之间的分子识别作定化条件为酶洛液浓度0.1mg/mL,固定化时间24用而进行的酶固定化方法受到了广泛的关注-8.利h.聚丙烯膜在烯丙胺等离子体处理前后,以物理吸附用生物素一亲和素之间的识别作用,将生物素固定在法进行酶固定化的结果如图2所示对于未经等离子载体上,进一步利用它去识别固定亲和素蛋白,最后通体处理的聚丙烯膜(1)经过物理吸附后其表面固定过固定化的亲和素上剩余的结合位点识别固定生物素的酶量仅为0.99mg/g,而且酶的活性也很低.当经过标记的酶分子然后对酶进行亲和素标记,可以得到具氩等离子体及50W.2min的烯丙胺等离子体处理有高酶活保留值和稳定酶活的固定化酶.如图3a所后膜上固定化酶的量及其比活性都得到明显提高.而示,经等离子体处理后的聚丙烯膜,采用生物素一亲和且,随着等离子体处理强度的增大,膜上固定化酶的量素的分子识别法,可以明显提高固定化酶特性活性.对及其比活性可以分别达到2.35mg/g和1.13U/mg,于以氩等离子体及50W,10min烯丙胺等离子体处相应的固定化酶膜的活性也得到提高.理后的聚丙烯膜,其固定化酶的量增大到3.30mg/g,对经氩和烯丙胺等离子体处理的聚丙烯膜,分别固定化酶的比活性更高达2.36U/mg,从而使得固定mobilized amount(a)mbrane activitbo己620MembranesStorage time /d图3戊二醛和分子识别法在等离子体处理后聚丙烯膜上固定化酶的结a)固定化酶量及其特比活性;(b)固定化酶储存稳定性:(○)中国煤化工寸法固定化酶的稳定性;(●)改性聚丙烯膜上以物理吸附法固定化酶的稳定性;(VCNMH固定化酶的稳定性(▲)改性聚丙烯膜上以分子识别法固定化酶的稳定性.所用改性聚丙烯膜均经氩及50W,10mi烯丙胺等离子处理Fig 3 Results of peroxidase immobilization onto plasma-treated polypropylene membranes by glutaraldehyde and mo万方数蝈 r recognition methods厦门大学学报(自然科学版)2007年化酶膜的活性达到7.79U/g比未改性膜采用物理吸[1] Moore c m, Akerson l, HIlLA D,etal. Improving the en附法得到的结果提高近17倍ronment for immobilized dehydrogenase enzymes by固定化酶的储存稳定性也是评价酶固定化方法的modifying Nafion with tetraalkylammonium bromides[J]个重要指标,图3b为固定化酶膜的储存稳定性.对Biomacromolecules 2004.5: 1241-1247于未改性的聚丙烯膜,物理吸附固定化酶的稳定性很[2] Karyakin AA, Kotel'nikova E A, Lukachova L V, et alOptimal environment for glucose oxidase in perfluorosul差,80d后酶膜的活性几乎消失.而对于氩及50W,10fonated ionomer membranes: improvement of first-generamin烯丙胺等离子体处理的聚丙烯膜,用三种方法固tion biosensors[J. Anal Chem, 2002, 74: 1597-1603定化酶后酶的储存稳定性都得到明显改善.与物理吸Sarin VK, Kent S B H, Tam J P, et al. Quantitative mor附法相比,虽然经过戊二醛键合后酶的特性活性不高但是稳定性比物理吸附法有所提高.采用分子识别法reaction[J. Anal Biochem, 1981, 117: 147-157固定化酶后.酶膜的储存稳定性得到显著改善,80d「4] Pahari I, Patel A B, Behere D v. Spectroscopic studiesαn后酶膜还可以保留约80%的活性tryptophan sensitized bound terbium (III) fluorescence3结论LJ. J Inorg Biochem, 1995, 60: 245--255[5 Amounas M, Magne V, Innocent C, et al. Elaboration and以烯丙胺等离子体处理聚丙烯膜表面,通过控制hemical reactivity of enzyme等离子体处理强度在聚丙烯膜表面引入了不同浓度的textiles[J]. Enzyme Microb Tech, 2002,31: 171-181氨基功能基团.分别以物理吸附法、戊二醛交联法和分[6] NicellJ A, Wright H. A model of peroxidase activity with子识别法进行辣根过氧化物酶的固定化,结果表明:与hibition by hydrogen peroxide [j]. Enzyme Microb物理吸附法相比,戊二醛交联法可以提高膜表面固定ech,1997,21:302-310化酶的含量,但是固定化酶的特性活性没有明显改善;7 Fisherman A, Levy T, Cogan U,etal. Stabilization of而分子识别法则可以显著提高固定化酶的特性活性horseradish peroxidase in aqueous-organic media得到具有高固定化酶膜活性的材料.经过表面改性后,mobilization onto cellulose using a cellulose-binding-do-main[J. J Mol Catal B, 2002, 18: 121-131种方法得到的固定化酶储存稳定性都得到明显提[8 Amounas M. Innocent C, Cosnier S, et al. A membrane高,其中分子识别法得到的固定化酶在80d后能保留based reactor with an enzyme immobilized by an avidin- bi80%的酶活,证明是一种非常有效的方法otin molecular recognition in a polymer matrix [J].J参考文献Enzyme Immobilization on allylamine Plasma-treatedPolypropylene membranesZHU Jian-ming(Xiamen Mchem Laboratories LTD. Xiamen 361022. ChinaAbstract: Allylamine plasma was applied to the hydrophobic polypropylene microfiltration membranes to generate amino groupson membrane surface. These amino groups were later utilized to immobilize peroxidase onto membranes via various methods includingphysical adsorption, glutaraldehyde crosslinking and molecular recognition based on the interaction between biotin and avidin. The reult reveals that compared with native polypropylene membrane, the surfaceprove the amount and storage stability as well as the working stability of im中国煤化工plasma can effectively imethods the mo-lecular recognition method is proved to be the most efficient one.CNMHGKey words: allylamine plasma; polypropylene membrane; peroxidase; enzyme immobilization