重组人角质细胞生长因子-Ⅰ的聚乙二醇修饰及体外活性

第26卷 第4期重庆理工大学学报(自然科学)2012年4月Vol.26No.4Jourmal of Chongqing University of Technology( Natural Science)Apr. 2012重组人角质细胞生长因子-I的聚乙二醇修饰及体外活性冯一建',陈勇”,张增涛’,黄 程',李红亮',胡春兰”,范 开',2(1.重庆理工大学药学与生物工程学院,重庆400054 ;2.重庆富进生物医药有限公司,重庆400041)摘要:研究大肠杆菌表达的重组人角质细胞生长因子-I型N端缺失突变体( ON23KGF-I)的mPEG-马来酰亚胺( mPEG-maleimide、mPEG-Mal)修饰 工艺及修饰位点和初步体外生物活性。首先修饰得到聚乙二醇化的ON23KGF-I,然后对ON23KGF-I作还原和非还原质量肽图,确定其各肽段,对ON23KGF-I-m PEG-Mal-20K做还原质量肽图,确定修饰位点。最后,通过BAF-3细胞对O N23KGF-I国际标准品、ON23KCF-I、ON23KGF-I-m PEG-Mal-20K测活。结果表明,在尿素环境下,mPEG-MAI被均一修饰在ON23KGF-I的Cys40位。与国际活性标准品相比，ON23KGF-I的活性保留了116%， △N23KGF-I-m PEG-Mal-20K 的活性保留了36%。关键词:重组人角质细胞生长因子;质量肽图;聚乙二醇修饰中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1674 - 8425(2012)04 - 0040 - 05Study on PEGylation of Recombinant Keratinocyte GrowthFactor-I and Activity in vitroFENG Yi-jian' ，CHEN Yong2 ，ZHANG Zeng- tao'，HUANG Cheng'，LI Hong-liang' , HU Chun-lan2, FAN Kail2(1. School of Pharmaceutical and Biological Engineering, Chongqing University of Technology ,Chongqing 400054, China; 2. Chongqing Fagen Biopharmaceutical Co. Ltd. , Chongqing 400041, China)Abstract : The research studied the PEGylation of mPEG -maleimide( mPEC -Mal ) of recombinant ke-ratinocyte growth factor-I mutant deleted on N-terminus( O N23KGF-I) expressed in E. coli, and i-dentified the modified site and preliminary biological activity in vitro. Firstly, get the Pegylated0N23KGF-I; Then, identify all the segments of the peptide by the reduced and non- reduced peptidemass mapping ( PMM). Next, identify the modifed site of △23 KCF-I-mPEG-Mal-20K by the reduced中国煤化工收稿日期:2012-01 -15基金项目:国家科技重大专项资助项目( 2012ZX09103MYHCNMH G科学基金资助项目(CSTC207BB5412)作者简介:冯- -建( 1986- -) ,男,硕士研究生,主要从事微生物与生化药学研究;通讯作者范开(1963- -) ,男,教授,硕士生导师,主要从事细胞生物学和肿瘤学研究。冯一建,等:重组人角质细胞生长因子-I的聚乙二醇修饰及体外活性41PMM. Lastly, measure the activity of AN23KGF- I international standard product, AN23KGF-I,ON23 KGF-I-mPEG-Mal-20K with BAF-3 cell line. And mPEG-Mal-20K is modified uniformly onCys40 when urea exists. In contrast to ON23 KGF-I international standard product, the activity ofAN23KGF-I keeps about 116%，and the AN23 KGF-I-m PEG-Mal-20K keeps about 36%.Key words : keratinocyte growth factor; peptide mass mapping( PPM) ; PEGylation人角质细胞生长因子( keratinocyte growth fac-tor, KGF)是具有肝素结合特性的成纤维细胞生长1 仪器与材料因子( fibroblast growth factor , FGF)家族中的一员，分为KGF-I(FGF-7)和KGF-II ( FGF-10)2种亚2487型高效液相色谱系统与紫外检测器型。成熟的KGF-I由163个氨基酸组成,包括( Waters); ESI-Q-TOF micro 型质谱仪及Massl-位于1.15.40、102和106位的5个半胱氨酸残基。ynx4. 0液质联用分析软件( Waters) ;AKTA Purifier天然的KGF-I不稳定,在温和的温度下也容易聚纯化系统(GE Health); 色谱柱SC300A C8(4. 6合。已经证实KGF-I的N端23个氨基酸残基缺mm x 150 mm,5μm) ;ulimate° XB-C18(4. 6 mm x失后的截短形重组人KGF-I (以下称O N23KGF-250 mm ,5μm) ;半胱氨酸(分析纯) ;胱氨酸(分析1)的稳定性得到提高,同时体内外生物学作用保纯) ; mPEG-Mal-20K(北京键凯科技有限公司生产); Trypsin singles ( Sigma,货号17575); 乙腈持不变[23]。在国外,经大肠杆菌表达的△N23KGF-I(商品( Sigma ,色谱纯) ;实验用水为Milli-Q超纯水。名Kepivance)在临床上用于肿瘤放疗、化疗后的BAF-3细胞株,齐鲁制药生产。口腔粘膜损伤或粘膜炎的治疗和保护。2方法△N23KGF-I的半衰期较短,约为4.5 h,需要在放疗或化疗前后连续给药6 d,用药量为60 μg/( kg2.1 ON23KGF-I 的重组制备●d)。为了实现延长其体内半衰期,进--步降低大肠杆菌菌体经IPTG诱导表达△N23KGF-I。免疫原性以及达到改6次连续给药1次的目的,在柠檬酸三纳/Tris的缓冲体系中,用常规的化学可以对ON23KGF-I进行聚乙二醇修饰。0N23KGF-I的N末端是KGF发挥生物学作破菌法破菌,再用SP Sepharose F. F.纯化,然后在用的重要区域,对ON23KGF-I的N末端进行PEG△N23KGF-样品中补加半胱氨酸-胱氨酸,摩尔浓修饰后其体外生物活性降低明显，所以不能对度分别为10 mmol/L和1mmol/L,在pH值为8.0,30 C下反应0.5 h,之后在含1 mmol/L的Tris透，△N23KGF-I进行N末端修饰[4]。而0 N23KGF-I析液中透析复性过夜。用Heparin Sepharose6 F.含有17个赖氨酸残基,对其定点修饰不能保证其F.含盐洗脱复性样品,再通过SDS-PAGE和RP-修饰的均一性,纯化难度极大,因此也排除。HPLC对样品进行纯度分析和定量分析。△N23KGF-I只含有3个半胱氨酸残基( Cys40,2.2△ N23KGF-I质量肽图分析102 ,106) ,其中Cys102-106已经形成一-对二硫键,参考文献[5-6]的方法对O N23KGF-I做还原只有Cys40一个半胱氨酸残基处于游离状态,因和非还原质中国煤化工此,可以选用常用的mPEG-马来酰亚胺(mPEG-2.3△ N23=修饰CNMH Gmaleimide、mPEC-Mal)对Cys40进行修饰。本文参考文献[7」,改变具修饰pH值(6.5、7.0、的主要目的是对O N23KGF-I的mPEG-Mal修饰工7.5),蛋白与mPEC-Mal-20K的摩尔比为1比4,艺进行研究,初步确认修饰位点和体外活性。反应时间为3 h,对蛋白进行饱和修饰。42重庆理工大学学报研究发现，mPEG-Mal-20K 不能修饰到94.0kDa-△N23KGF-I.上,因此,考虑在变性剂尿索的环境45.0kDa-33.0kDa-下修饰目的蛋白。在尿素浓度为1、2、3、4 molL,20.0kDa一023KGF-I蛋白与mPEG-Mal-20K的摩尔比为1比4,pH值14.4kDa- +为6.5的条件下修饰3 h。再通过SDS-PAGE和RP-HPLC对样品进行纯度分析和定量分析。2.4 O N23KGF-I-mPEG-Mal-20K的纯化12345△N23KGF-I-mPEG-Mal-20K样品稀释5倍,1 ~3:0.4、0.5.0.6 M NaCl SP elution;经SP Sepharose F. F.纯化,方法同本文2.1节。4~5:0.5 、0.6 M NaCl Heparin elution2.5△ N23 KGF -I-mPEG-Mal-20K质量肽图分析图1样品凝胶 电泳参考文献[5-6]的方法对△N23KGF-I-mPEG-50000Mal-20K做还原质量肽图。4002.6△ N23KGF-I及O N23KGF-I-mPEG-Mal-20K300体外活性测定2502.6.1 供试品溶液的制备150100样品( ON23KGF-I国际标准品、△N23KGF-1、_儿△N23 KGF-I-mPEG-Mal-20K)用无菌超纯水稀释,2468101214161820222426当稀释至4μg/mL时用0.25%FBS+培养液稀释t/min20倍,得200 ng/'mL, 以此为起始浓度,做4倍系图2△N23KGF-I Sepharose F. F.纯化列稀释,共10个稀释度,每个浓度做2个孔。3.2△ N23KGF-I质量肽图分析2.6.2活性测 定参考文献[5],由图3、4可以得出结论:BAF-3细胞株(转染了KGF-2受体)用常规方△N23KGF-I的Cys102和Cys106形成了二硫键。法培养,使1 mL溶液含2.0x10* ~4.0x10'个细胞。离心收集细胞,用0.25%FBS+培养液洗细胞3次,用0.25% FBS +培养液配成每1 mL含2.0x10°~4.0x 10个细胞的细胞悬液,37C备用。在96孔细胞培养板中加人供试品溶液50μL/孔,并设立阴性孔2孔,再加入细胞悬液50 μ[/孔。置37C、5%二氧化碳培养48 h。每孔加入MTS溶液20 μL,于379C .5%二氧化碳培养0.5 h。250/min混匀后在酶标仪上,波长490nm处测定吸光度,图3 O N23KGF-I还原质量肽图记录并分析处理结果。3.3 ON23KCF-I 的Cys40聚乙二醇修饰3实验结果与讨论实验发现,在没有变性剂的情况下,mPEG-Mal中国煤化工GF-I.上。在pH值为3.1 △N23 KGF-I的重组制备:YHCNMHG时,修饰率只有50%;通过洗脱条件的优化，得到高纯度样品(图1、当尿素浓度达到3 mol/L时,修饰率达到85%左2),纯度达到98%。右;当尿素浓度达到4 mol/L时,修饰率达到95%冯一建，等:重组人角质细胞生长因子-I的聚乙二醇修饰及体外活性43(图5 ~6)。△N23KGF-I-mPEC-Mal-20K的RP-是图8中黑框的肽段,即含有Cys40的肽段,证明HPLC出峰时间和△N23KGF-I的出峰时间相同，mPEG-Mal-20K修饰到了△N23KGF-I的Cys40。不能用其进行RP-HPLC分析。t/min山业图7 ON23KGF-I -mPEC-Mal-20K质量肽图.1230503353图4 ON23KGF-I 非还原质量肽图SYDYMEGCDI RVRELFCRTQ WYLRIDKRGK VKGTQEMKNN YNIMEIRTVA VANAIKGVE103 1132 123 133 143SEFYLAMNKE GKLYAKCN EDCNKEUIL ENHYNTYASA KWTHNGCEMF VALNQKGIPV16315394.0kDaRCEETKKEQK TAHFLPMAIT66.2kDa45.0kDa日8 ON23KGF-I氨基酸序列33.0kDa26.0 kDa3.6 ON23KGF-I 及ON23KGF-I-mPEG-Mal-20K20.0kDa体外活性测定港14.4kDa△N23KGF-I有促进表皮细胞增生的生物学1~3:pH值为6.0.6.5.7.0时的修饰情况;活性的作用。蛋白活性越高,细胞生长越好,显色4: AN23KCF-I .越深。通过对实验结果的分析和处理(见表1)可图5不同pH值的mPEG-Mal修饰ON23KGF-I情况以看出,本实验纯化的蛋白活性良好。表1 蛋白活性66.2 kDaSamplesActivity/(IU●mg"')%0N23KGF-II. s. P1.0x 10°10026.0kDa△N23KGF-I1.16x 10°116O N23KGF-I-mPEG-Mal-20K3.6x 10°14.4kDa 141~4:尿素为1.2.3 .4 mol/L时修饰情况;4结束语a: 0 N23KGF-I mPEC-Mal-20K图6 不同尿素浓度的mPEG-Mal修饰△N23KGF-I情况通过对△N23KGF-1做还原、非还原质量肽图3.4△N23KGF-I-mPEG-Mal-20K 的纯化以及对△N2KCHPFE角慌化华牧还原质量肽当修饰后的样品经过SP Sepharose F.F.后,图,可以确iY片CNMHGPH值为6.5能够得到纯度达到95%的修饰蛋白。时, mPEC-Mal-20K硼实均一修饰到了O N23KGF-I3.5△ N23KGF-I-mPEG-Mal-20K质量肽图分析的Cys40.上, 而不是修饰在Cys102或Cys106上。由图7可见只有位置C的肽段消失,而这正在没有尿素的情况下，蛋白不能被修饰，可能是44重庆理工大学学报Cys40处于ON23KGF-I空间结构的内部,缺少与PEG的接触机会的缘故。在体外活性初步测定参考文献:中,对比O0 N23KGF-I国际活性标准品,△N23KGF-[1] Jffrey S R,Hiroyuki 0. Purification and characterizationI的活性保留了116%，△N23 KGF-I-mPEG-Mal-of a newly identified growth factor specific for epithelial20K的活性保留了36%，说明本实验纯化得到的cells[J]. Biochemistry , 1989 ,86 :802 806.蛋白活性已达到标准品的水平。标准品的活性相[2] Dina Ron ,Donald P B ,Paul W. Finch. Expression of Bio-对低,这可能是标准品存放的时间相对较长,活性logically Active Recombinant Keratinocyte Growth Factor[J]. Biological Chemistry , 1993 ,268(4) :2984 -2988.有所下降。△N23KGF-I-mPEG-Mal-20K 的活性偏Eric H, Timothy 0. Enhanced Stability of recombinant低,则可能是因为大分子PEG占据了很大的空间,keratinocyte growth factor by mutagenesis Protein Engi-影响了蛋白与受体的结合,影响了蛋白的生物活neering[ J]. Design & Selection ,2006 , 19(4) :147-153.性发挥。但是如果其生物学作用能够维持到3d[4] 宗宪磊,蔡景龙角质细胞生长因子研究进展{J].中国修复重建外科杂志,2009 ,23(2) :188-192.以上(效果等同于3 d连续给药△N23KCF-I),虽然单次给药量增加了,但给药次数减少了,病人的张增涛,陈清,罗岚,等.重组人角质细胞生长因子1型缺失突变体二硫键配对与生物活性[J].重庆理工痛苦减小了,这还是有优势的。3 mol/L尿素的已大学学报:自然科学版,2010,24(5) :44-53.经改变了ON23KGF-I原本的空间构象,修饰后的[6] 饶舂明,陶磊,史新昌,等.重组人干扰素d Ib质量肽空间结构也可能发生了改变,因此很可能产生新图分析及二硫键定位[J].药物分析杂志,2007,27( 10) :1505-1510.的生物学活性,这需要实验来证明。[7] Antoni Kozlowski. Maleamic acid polymer derivatives and在常规条件下,若蛋白不能被PEG或其他大their bioconjugates [P]. USA patent: US 7329721 B2.分子修饰,可以考虑在其中补加适量的变性剂后2008-02-12.再进行修饰。(责任编辑刘舸)(上接第10页)[8] 吴光强,杨伟斌,秦大同.双离合器式自动变速器控制系统的关键技术[J].机械工业学报,2007 ,43(2):13[1] 胡建军,李光辉,伍国强,等.汽车起步过程离合器传9] 操剑锋.湿式DCT仿真技术研究[D].长春:吉林大学,2007.递转矩精确计算分析[J].汽车工程,2008 , 30(12):[10] 张世义,李光辉.双离合器自动变速汽车起步模糊控1083 - 1086.制研究[J].重庆交通大学学报,2009(8) :794 -799.[2] 孙文凯,严运兵,刘旺.汽车离合器起步接合过程的仿[1]李光辉.双离合器自动变速系统离合器转矩控制研究真研究[J].武汉科技大学学报,2006,29 (4):368[D].重庆:重庆大学,2008.-371[12] 屠海峰.基于DCT结构的动力换档过程研究[D].重[3]余志生. 汽车理论[M].北京:机械工业出版社,2004:庆:重庆理工大学,2010.[13] Manfred Mitschke , Henning Wallentowitz. 汽车动力学[4] 葛安林.车辆自动变速理论与设计[M].北京:机械工[M].北京;清华大学出版社,2009.业出版社, 1991:107 - 108.[14] 吴佐铭,褚超美,黄明礼.双离合自动变速器技术研究[5] 黄建明,曹长修,苏玉刚.汽车起步过程的离合器控制进展与应用现状[J].机械设计与制造,2008(11):241[J].重庆大学学报:自然科学版, 2005,28(3):91- 243.-94.[15]中国煤化工于AMESIM 的DCT车辆6] 李瑜婷,赵治国,章桐. DCT变速器双离合器压力最优“TCH.CNMH G}.重庆理工大学学报:自控制方法的仿真研究[J].中国机械工程,2010,21u11/v- 11.(12):1496 - 1501.[7]刘 文卿.实验设计[M].北京:清华大学出版社,2005.(责任编辑陈松)