蛋白药物聚乙二醇化技术的研究进展

中国临床药理学杂志.。226.。2003年6第19番第了期(总第83期1特约综述SPECIAL REVIews蛋白药物聚乙二醇化技术的研究进展Research Development on The Protein Drug PEGylation TechnologyR9 A李力’郑意端摘要蛋白药物聚乙二醇化技术是指-项利用聚乙。二醇衍生物对蛋白药物进行化学修饰的技术。聚乙二醇的代表药物有:腺苷脱氨酶、干扰崇a -2b和干扰索a -2a等。它可以改善药物的可溶性和稳定性，减少免疫原性和蛋白水解，显著增加体内循环时间，以及在作州部位提高药物浓度和延K驻留时间从而提高疗效。本文对该技术进行了综述。(深圳市清华源兴生物医药科技有关键词聚乙二醇衍生物; 化学修饰，蛋白药物限公司，广东深圳518057)中国临床药埋学杂志2003, 19(3)226 ~229Abstract The protein drug PEGylation technology is a technology that chermicallymodifies protein drug by polyethylene glycol derivatives. There were the proteindrugs PEGylation such as adenosin deaminase, x -2b-interferon, a -2a-interferon,ctc. It can improve solubility and stability of drugs. reduce immunogenicity andproteolysis, greatly increase circulation time and improve efficacy due to increasedLILiconcentration and longer dwell time at the site of action. The technology is reviewedZHENG Yi-duanin this paper.Key words polyethylene glycol derivative; chemical modification; protein drugChin J Clin Pharmacol, 2003, 19(3)226 ~229聚厶二醇(polyethylene glycol, PEG)是: .种无毒、 高吸水性的大分子聚(Shenzhen Tsinghua Yuanxing合物，是由忆_醇单体: HO-(CH,CH2O)-CH2-CH2-OH聚合而成，根据构成的单体数量不等聚合成分子量从几白至儿万的高分子材料。由于PEG无Bio-pharma Science and Techno-毒，并APEG分子中存在大量乙氧基，它们能够与水形成氢键，使PEG具logy Co., LTD, Shenzhen 518057)有良好的水溶性，囚而成为一种被)泛使用的化学修饰材料。口前，PEG化学修饰普遍采用的是单甲氧基聚厶二醇(mPEG)，分子组成为: CH,O-(CH2CH,2)-CH2-CH2-OH."。聚乙二醇末端的羟基是其化学反应的功能基团，但必须在较激烈的条件下才能与其他基团发生反应，因此必须通过适当方式活化后，方叮用于各类蛋白质药物的化学修饰，活化后形成的端基在聚乙二醇的应用中起若决定性的作用，不同的端基具有不同的用途。收稿: 2003 05-10活化后形成的聚乙二醇衍生物的构型，可以分为线型和分支链，而根修网: 2003-05-25据活化后聚C二醇链两端端基的同还可以分为同端基聚乙二醇和异端基°通讯作者Tel:(075526980713Fax:(0755)26980584聚乙二醇'。E-mail: 1ili@thyx.com聚乙二醇活化的方法主要有:氰尿酰氯法、羟基琥珀酰亚胺法、琥珀中国煤化工YHCNMHGChin J Clin Pharmacol27_June,2003.V0lL 19No.3YSereINo.83)酸酐及琥珀酰亚胺两步活化法等。其中羟基琥珀酰亚化学研究所、中国科学院成都有机化学研究所等。胺法活化的PEG应用比较广泛。国内关于聚乙二醇衍生物和聚乙二醇化技术的研聚乙醇衍生物(分子量一般为5 000-20 000，也究和开发，目前大多数还是局限于科研院所和学校，有30 000或更高)可与蛋白质分子侧链上的氨基.巯基产业化水平较低，尚处于初始阶段。存在的问题主要和羧基等化学基团反应从而与蛋白质相偶联51.有:①聚乙: _醇修饰剂(PEGs)基本从国外进口，产品价根据偶联基团的不同，话化后聚乙:醇街生物时格很高; H前尚未有国内1“家生产、销售该类产品，分为:氨基修饰用烷基化PEGs和酰基化PEGs,如PEG-②制备1.艺尚不成熟，包括活化聚乙二醇，制备成为醛、PEG-环氧化物、PEG- 琥珀酰亚胺酯;巯基修饰用聚乙二醇衔生物以及利用聚乙二醇衍生物对药物进行PEGs,如PEC- 马水酰亚胺、PEG- 邻毗啶。二硫醚，和修饰的工艺目 前还局限于实验室，不具备产业化的条羧基修饰用PEGs,如PEG- 酰肼。件，另外对中间产物和终产品进行检测的仪器和设备也不够先进，③研究与开发的结合程度不高，这也是聚乙二醇修饰目前中国研究机构与制药企业之间存在的-一个主要问聚厶二醇修饰(PEG modification)又称分f的PEG化题:团任专利上受到限制，由于国内起步较晚，作为(PEGylation),赴20世纪70年代后期逐渐发展起来的一研发生产聚乙二醇 衍生物的领先企业，Nektar公司已项热门技术"，是用水溶性聚合物修饰药用物质的方经成功开发出20多种聚乙二酶衔生物(包括第2代产法之-.它可以解决化合物、蛋白和多肽等物质在临品)，并申请了专利:其次Roche公司和Schering-Plough床应用过程中存在的诈多问题。公司针对聚乙.:醇干扰素的应用也进行了专利保护，目前有很多药物，特别是蛋白质类大分子、抗肿因此能否绕开专利问题这也是开发聚乙二醇药物的一一瘤新药由于免疫原性强、毒副作用大，因而限制了它个主要问题。国内的研究目前主要集中在PEG修饰后药物的理们在临床上的应用，而某些药物由F血浆半衰期短,化性质和话性研究、动物有效性研究和聚乙二醇修饰为了获得显著的临床效果，不得不加大给药剂量和给剂及修饰条件的优化。罗氏公司的PEGASYSTM已F药次数.从而带米严重的毒副作用。相比之下，聚乙2003年I月获得SFDA批准开始进入中国市场，而先灵二醇修饰后以增加溶解性利稳定性，延长血浆半衰僚雅公司的PEG Intron AM也在申请进口批准的临床中。期，降低免疫原性和抗原性，降低毒副作用和.提高2.2国外研究现状膜的渗透性。原因如下。①PEG的甲基中含有大量的氢原子，氢键川与水分f结合，从而增加了溶解性。国外的研究，包括聚C二醇衍生物的制备和聚乙②PEG干扰了细胞清除机制，增加了蛋白质类分子对二醇药物的开发日前都处于领先的地位。见表1。血循环中蛋白酶和胰酶的抵抗,③PEG化后，分子质表1 国外上市的聚乙二醇药物量增大，皮下注射后吸收缓慢，由于流体半径加大导产品(商品名)临床应用上:市时间致肾小球滤过减少，降低肾脏排泄，④PEG 本身不具腺茌脱胺酶免疫缺陷性疾病1990-03有免疫原性，PEG化后，PEG速盖了蛋白的抗原决定簇，(ADAGENT*)从而降低免疫原性和抗原性。此外，PEG 修饰还体现犬冬酰胺酶白血病、黑索瘤194-42在体内活性提高而体外活性降低，该作用在GM-CSF.(ONCASPARTMIY1L2、L6. TNF a和IFN v及其他生物分子上也得到干扰素a-2b(PEG-INTROND)慢性丙肝2000-05体现t"1。干扰素a -2b+利巴韦林丙肝2001-08因此，越来越多的PEG化蛋白质药物上市或者进(PEG-INTRONTM+REBETOLM)人临床，例如Enzon公司开发的治疗免疫缺陷性疾病T扰素a-2u代偿性肝病、慢性丙肝2001-08的腺背脱胺酶(ADAGENM)，治疗白血病、恶性黑色素(PEGASYSMI)瘤的PEG化天冬酰胺酶(ONCASPARTM. PEG 化干扰索干扰索a-2a+ 利巴5林代偿性肝病、慢性丙肝2001-12a -2b (PEG INTRONMI),罗氏的PEG化干扰索a -2a .(PEGASYSTM+COPEGUSIM)(PECASYST)第。粒细胞集落刺激因子粒细胞减少症2002-01(NEULASTARI Pegflgrastim)2药物聚乙二醇化技术的国内外研究现状生长抑素肢端肥大症2002-112.1国内研究现状(SOMAVENT/pegvisomnant)PEG-水凝胶防止手术后粘着2001-11国内开展有关聚乙二醇研究的主要有中国药科大SprayGelTM Adhesion(欧洲)学、沈阳药科大学、天津大学、中国科学院上海生物BarrerSystem中国煤化工MYHCNMHG中国临床药理学杂志。2282003年6月第19在第了期(总第83期从表1可以看出，在1年多的时间内共有3个聚乙举例说明如下。:醇产品上市。腺苷脱氨酶(adenosine deaminase) 聚乙二醇腺苷从表2也可以看出，到口前为止，国外共有28个脱氨酶是世界.上第一个上市的聚乙二醇药物，用于治品种处于临床前研究的不同阶段。相信在不久的将来，疗严重联合免疫缺陷性疾病SCID (severe combined会有大量的聚C二醇药物上市，而且随脊我国进一步immunoideficiency disease ,SCID)是因干细胞分化缺陷而的开放，国际化趋势的进-步加强，也会有更多的药表现T、B细胞减少，体液和细胞免疫均缺陷。出生6个月起发病，对各种类型感染均易感。约20%SCID由物进人中国市场。腺背脱氨酶缺陷引起。目前针对SCID主要是采用基因表2国外处于临床阶段和临床前研究的聚乙二醇疗法，但由于基因疗法受到诸多限制，例如有效性和药物安全性等方面'91。而聚乙二醇腺甘脱氨酶u[以不同程产品(商品临床应用仙床前度的恢复患者的免疫功能，且耐受良好、无过敏反应。研究阶段天冬酰胺酶(asparaginase) L天冬酰胺酶(ASNase)超氧化物歧化酶(PEG-SOD)脑损伤终市能够催化L天冬酰胺水解成L天冬氨酸，将其与其他干扰素a -2b(PEG-INTRONT)白血病皿期化疗药物相结合是治疗白血病的一-种有效手段， 但由干扰索a -2b(PEG-INTRONT)恶性黑色素瘤田期十它在血液存留时间短，长期接受治疗的白血病病人+扰素x -2b(PEG-INTRONM)实体瘤、HIVu期需要经常注射。而ASNase是从大肠杆菌中提纯川来喜树碱(PROTHECANTM/非小细胞肺癌、小细胞I期的，在重复注射的条件下容易引发危险的免疫反应"0。PEG-camptothecin)肺癌、胰腺癌.胃癌.PEG修饰后L天冬酰胺酶可以降低免疫原性，聚乙人血白蛋白血浆代用站1/1期二醇天冬酰胺酶(ONCASPARTM) 于1994年2月上市，牛血红蛋白(PEG-hemoglobin)癌症I期紫杉酶(PECG-paclitaxel)晚煳实体瘤和白血病I 期是第2个被批准的聚乙二醇药物，用于治疗急性淋巴尿酸酶(PEG-Uricase)痛风性白血病和恶性黑色素瘤。细胞毒索(PEG-cytotoxics)临床前近几年，新的梳状PEG衍生物分子PM 13(分 子量单链抗原结合蛋白(PEG-SCAs)约13 000)和PM 100(分f量约100 000)也被用于蛋白质干扰索a-2a(PEGASYS")乙肝①期的修饰。与线状的PEGI和分枝状的PEG2相比，PM下扰紊a -2a+盐酸组胺病症、丙肝修饰的ASP在较低修饰程度时即能降低免疫反应性，(PEGASYSIM+ Maxamnine)同时保留较高的酶话性11.121。+扰素ax-2a+利巴书林丙肝山期干扰素(interferon IFN) lFN 是一类能提高机体免(PEGASYSM+ COPEGUSTM)粒细胞集落刺激因了1期疫力，具有抗病毒、抗肿瘤作用的细胞因子。抗病毒作用是通过在细胞内诱发一种对抗病毒感染的状态和(Pegylated G-CSF)肿瘤坏死因子(PEG-sTNF-RI)风湿性关节炎0期调节免疫系统的效应去中和病毒或清除受病毒感染的聚乙二醇抗-TNF a抗体片断JCDP870凤湿性关节炎I /四期细胞。1FN 的抗肿瘤机制尚不明确，但它能引起人类肿(PEG-anti-TNF a antibody fragment)瘤细胞的以下几种改变。人类肿瘸细胞显示出DNA.聚乙醇抗PDGF- B受体肿瘤RNA和蛋白合成的显著减少;在体外试验能对多种人人源化抗体片断CDP860类肿瘤细胞发挥共抗增生作用;抑制移植到裸鼠的人CDP 791/PEG-Anti-GFR antibody临床崩类肿瘤细胞的生长。CDP 484/PEG-Anti-IL- Ibeta antibody炎症疾病目前，PEG修饰的IFN a即PEG INTRONM (聚乙干扰索a-l(PEG-infergen)丙二醇千扰素a -2b)于2001-01上市，PEGASYSTM (聚乙MACUGENTM(PS*)渗出性(湿性)凹期二醇干扰素a -2a)于2001-08上市。用于治疗丙肝的抗VEGF的Aptamer老年黄斑变性(AMD)PEG-IFN a -1和PEG-interferon β -Ia都正处于1期临床。睫状体神经营养因子, CNTF严重肥胖修饰后的IFN a具有如下特性。增加了生物利用(PEG-Axokine )干扰素- B -1a(PEG-interferon β -1a)度，增强了有效性和安全性，减少了免疫原性和毒性生长徼素释放因了(PEG-GHRF)以及延长了半衰期。水蛭素(PEG Hirudin)外科:手术I期.粒细胞集落剌激因子(granulocyre colony stimulaing尿酸酶(Puricase 1 PEG-Uricase)factor, G-CSF) 分子量为19000左右，叮诱导造血干细白介索-2(PEG-IL-2)抗HIV感染胞的增殖和分化，致血液中的中性粒细胞数月增加，PEG-水凝胶防止手术后粘着美国咖另外它还能刺激成熟中性粒细胞从骨髓中释出并激活*PS: pegaptanib sodium.中性封细胞的功能常用千治疗因化疗或先天原因导中国煤化工YHCNMHGChin J Clin Pharmacol229」Jan.2003.Vo. 19No XSeriaNno.43)致的血液中中性粒细胞数口减少等症。GCSF 的毒性较4结语轻，半衰期知短"。聚乙:醇药物是在原有药物的基础上，通过改良PEG修饰G-CSF于2002.1上市，它对多核性中性粒产品特性来进-步扩大临床应用范围。由于聚乙醇细胞引发功能和集落刺激功能发生分离|41，前者在化技术为药物带来了许多优良的产品特性，开拓了新PEG修饰后增强，而后者保持不变或减弱，说明用PEG药研发的新领域。修饰某些蛋白质分子可精细地改变其生物活性范围，从而开粹新的临床应用范围。参考文献:超氧化物歧化酶(superoxide dismutase. SOD)能1川够催化氧自由基的歧化反应，足机体消除有害氧自由perspectives. Int J Pepr Protein Res, 1987:29:145.基的重要的酶。大多数氧A白由基在头部创伤部位的脑[21 魏米.聚乙二醇化干扰索及在内型肝炎治疗中的应用.新消化杂志、2001;9:1296-1299.血管晚处存积时，可造成神经元损伤、局部缺血性神[3|付春晓 蛋白的聚乙二醇修饰及其在生物医学领域的应用。经元损伤和血管损伤，从而导致血管痉挛。SOD对放国外医学一药学分册. 2001:28:78-81.射性损伤、氨巾毒、再灌性损伤以及各种炎症，尤其[4」 熊成东，王亚辉，袁明龙，等.聚乙二醇術生物的合成研是对类风湿关节炎均具有良好的治疗作用9)。究进展.高分了通报，2000;1:39-45.但该酶有生物半衰期短，异体蛋白免疫原性和忠15) Veronese FM. Peptide and protein PEGylation: are view of pro-者不易吸收利用等缺点，因而限制了其临床应用。该blems and solutions. Biomaterials, 200122:405-417.酶经过聚乙“:醇修饰后，克服了以上缺点。可用于治.161 关洁，刘景晶、胡卓逸。蛋白质药物的聚厶二醇修饰.药疗脑损伤的聚乙二醇SOD正处于申报阶段。学进展.2002;26:146-151.肿瘤坏死因子(umor necrosis factor TNF) TNF- a[7| Yuji I, Makoto F. Hideyuji s, et al, Biomedical and biotchnologicalI applications of PEG-and PM -modified proteins. Tibrech, 1995:是由激活巨嗜细胞产生的-种蛋白，具有重要的生理13:86-91.功能。它具有协同的抗肿瘤效能: - - 方面直接表现为8] Frrggia B. Nerli B. Nuci HD, et al. Thermal features of the对肿瘤细胞的细胞毒作用:另方面可激话宿主的抗bovine senum albumnin unfolding bhy polyethylene glycols. Int J Biol肿瘤应答并选择性地|起肿瘤组织内部的微循坏障碍。Macromol, 199;26:23.但是，TNF- a在体内的清除速率很快，要产生明显的9] Fischer A. Hacein Bey s, Cavazzana-Cavo M, et al. Gene therapy抗肿瘤效果需要非常大的使用剂量，由此常引发一系of severe combined immunodeficiencies. Nature Reviews Immuno-列肛重的毒副作用，包括发热、组织炎症和组织损伤，logy, 202:615-621.甚至是致命的内毒素性休克样综合征。PEG修饰可以[101 Francois JI Frotier G. Immobilization of L asparaginase intoa biocompaible poly(ethylene glycol)albumin hydrogel I: prepar-明显升高TNF- a的生物活性，通过减少给药剂量达到ation and in viro characterization. Biotechnol App! Biochem,降低毒副作用的目的1。可用于治疗风湿性关节炎的1996;23:221-226.PEGs-TNF-R1正处于I期临术。[11] Sekine T. Kodera Y. Saito T, et al. L asparaginase modified by poly(ethyene glycol) derivative with a comb shaped form anti tumor3药物聚乙二醇化技术的专 利情况activity and induction of immune lolerance. Biomed Res, 199;目前国内已授权的聚乙:二醇专利情况共计4篇，其16:121.中涉及聚乙醇干扰素制备的专利有2个;涉及聚乙[12] Kodera Y,:kine T, Yasukohchi T, er al. Stabilization of L aspar-二醇应用于巨核细胞生长发育因子MGDF多肽的专利aginase modified with comb shaped poly(thylene glycol) deriv-有1个:涉及聚乙二醇蛋白质结合物的制备方法的专atives, in vivo and in viro.Bioconjugate Chem, 1994;5:283.利有1个。13] 印春华，张敏蛋白质和多肽类药物的聚乙二醇结含物一-种新型给药系统.中国药学杂志, 2001;36:292~296.另外还有22篇涉及聚乙.:醇的专利在公开阶段。目前国内机构和个人申请井已公开的专利有6个，[l4] Knusi c, Delgado C, Malik F. et al. Polyethylene glycol(PEG)modification of granulocyte macrophage colony stimulating factor说明国内已经开始注重聚乙二醇修饰的研究和开发，(GM CSF) enhances neurohilprining activity but not colony但较国外相差还很远。stimulating acivity. Br J Hematol, 1992:82:654~663.在全部授权和公开的专利中，国外制药大公司掌15] Somack R, Saifer M G, Wiliams L D. Preparaion of longactng握了大部分的聚厶二醇相关专利(共计20个),涉及superoxide dismutase using high molecular weight polyethylene的范围包括聚乙:醇 干扰素制备、聚乙二醇干扰索治glycol. Free Radic Res Commun, 1991;12/13:553-562.疗应用、促红细胞生成素、脑神经营养因卜BDNF多[16] Tsusumi Y, KihiraT, Yamamoto s, et al. Chemical modification肽、巨核细胞生长发育因子MGDF多肽和聚乙二醇街of natural human tumor necrosis factor alpha wilh polyethyleneglycol increases its anti tumor potency. Jpn J Cancer Res, 1994;生物的制备等方面。85:9-12.中国煤化工MHCNMHG