添加剂促进变性还原溶菌酶复性的作用

第37卷第7期天津大学学报Vol.37 No.72004年7月Jourmal of Tianjin UniversityJul. 2004添加剂促进变性还原溶菌酶复性的作用董晓燕，黄艳，孙彦(天津大学化工学院,天津300072)摘要:研究了多种添加剂促进变性还原溶菌酶复性的作用。考察了添加剂浓度及变性剂盐酸胍浓度对复性收率的影响.结果表明,精氨酸、乙酰胺、丙酮、硫脲及甘油均能有效促进变性溶菌酶复性,并且存在最佳的添加剂浓度使变性溶菌酶的复性收率最大.在促进复性中,乙酰胺等结构类似物与盐酸胍具有相同作用,因此,在降低复性液中盐酸胍浓度的同时,适当提高乙酰胺浓度即可获得较高的复性收率.当盐酸胍浓度为0.2 mol/L时,复性收率达.到90%时的乙酰胺浓度为2 molVL, 但降低盐酸胍浓度至0.06 mol/L时,达到相同变性收率的乙酰胺浓度需要4 molVL.甘油与盐酸胍存在着协同作用,在一定浓度的盐酸胍存在下,添加适量的甘油能获得较高的复性收率,关键词:溶菌酶;复性;稀释剂;变性中團分类号: 0629. 73;0643.1文献标志码: A文章编号: 0493- 2137(2004)07-0643-04Role of Various Dilution Additives on the Refolding ofDenatured-Reduced LysozymeDONG Xiao-yan, HUANG Yan, SUN Yan(School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China)Abstract: The role of various dilution additives on the refolding of denatured -reduced chicken egg white lyso-zyme was investigated, and the efet of the concentrations of guanidinium chloride ( GdmCl) and the additiveswas studied to find proper refolding conditions. It was found that the addition of arginine, acetamide, acetone,thiourea and glycerol was effective in improving the refolding yield. In addition, there was an optimal additiveconcentration for each additive, which made the refolding reach the highest yield. It was also found that the re-folding-promoting mechanism of acetamide, arginine , acetone and thiourea was the same as that of GdmCl,i. e.GdmCl could be replaced by these additives as the refolding promoter. For example, at a CdmCl concentationof 0.2 mol/L, the presence of 2 mol/L acetamide improved the refolding yield to 90%, while at a low GdmClconcentation (0. 06 mol/L), 4 mol/L acetamide was needed to yield 90% refolding. On the other hand, the.effct of glycerol and GdmCl on protein refolding was additive. That is, increasing glycerol concentration at aproper GdmCl concentration could obtain a high refolding yield of protein.Keywords: lysozyme; refolding; dilution additives ; denaturation变性蛋白质的疏水基团外露.在复性过程中,随着增大 ,就显得尤为突出" ,因此,抑制肽链分子间的聚变性剂浓度的下降,外露的疏水基团相互作用会生成集作用,提高变性蛋白质的复性收率成为当前蛋白质大量的聚集体.这种聚集作用在变性蛋白质浓度较低复性工作的研究焦点.时不明显,当浓度升高时,由于伸展肽链间的碰撞几率向复性稀释液中加入某些添加剂在很大程度上可收稿日期:0030- 03- 14;修回日期:003- 08- 19.中国煤化工基金项目:教育部优秀青年教师基金资助项目.MYHCNMHG作者简介:董晓燕(1962- ) ,女,教授,ysun@ tju. edu. cn.。644●天聿大学学报第37卷第7期缓解肽链分子间的疏水作用,提高变性蛋白质的复性聚集促进复性,且盐酸胍浓度对最终的复性收率影响收率(2].添加剂价格低廉且稀释添加法操作简便,因较大[51].为便于观察添加剂对变性溶菌酶复性的影而具有很大的工业化应用前景.但添加剂促进变性蛋响,首先确定了本实验条件下盐酸胍的合适浓度;选择白质的复性作用与其结构、性质密切相关(BI ,并且相了自发复性收率为50%的盐酸胍浓度0. 2 mol/L.同的添加剂对不同的变性蛋白质复性作用不同[4].为研究指出,盐酸胍分子中的某些集团与抑制分子进一步阐明不同添加剂在促进变性蛋白质复性中的作间聚集反应有密切关系[3),并且研究证明,精氨酸作用,以变性还原的溶菌酶为模型蛋白,采用稀释添加法为添加剂也可抑制变性蛋白质聚集,促进蛋白质复考察了多种添加剂促进溶菌酶复性的作用,讨论了添性').另外,向复性稀释液中加入一-定浓度的甘油在加剂浓度对复性收率的影响,同时探讨了添加剂与变一定程度 上也提高了变性溶菌酶的复性收率”.为了性剂(盐酸胍)在促进溶菌酶复性中的相互关系.进一步分析添加剂在促进变性蛋白质复性作用上存在的共性和差异,寻找更多的有效添加剂，笔者选用了与1材料和方法盐酸胍结构类似的乙酰胺、丙酮、精氨酸和硫脲,与精氨酸的类似物甘氨酸和天冬酰胺,甘油及其相关的醇1.1 实验材料溶菌酶( lysozyme)、溶菌酶底物微球菌( M. lyso-类物质(乙醇和D-山梨醇) ,具有环状结构的葡萄糖和deikticus) 、盐酸胍( GdmCl)、二硫苏糖醇( DTT)和氧化具有胺基的丙胺作为添加剂，分析比较了这些物质对型谷胱甘肽( GSSC)均购于Sigma公司,三羟甲基氨基促进变性溶菌酶的复性作用,如图1所示,其中甘氨酸甲烷(Tris)购于Promega 公司,还原型谷胱甘肽和精氨酸浓度为0.5 mol/L,甘油浓度为3.2 mol/L,其(GSH)购于日本USB公司,其它试剂均为分析纯.它添加剂浓度为1 mol/L.1.2溶菌酶的变性将20 g/L溶菌酶溶液(含有30 mmol/L DTT,6D.山梨醉8|mol/L GdmCl和0. 1 mol/L Tris-硫酸缓冲液,pH =甘油8.5),置于37 C ,120 r/min的摇床中反应1 h,使溶菌葡萄糖酶彻底变性和还原.天冬酷鞍甘氨酸1.3溶菌酶的复性用适量的复性缓冲液(0.1 mol/L Tris-硫酸缓冲液,pH=8. 5,1.0 mmol/L EDTA,实验设计量的GSSG乙酸妆和GSH)稀释变性溶菌酶,并添加适量的GdmCl和添020406080100020406080100加剂,于37 C,150 r/min下复性并在不同的复性时间R.1%R,1%取样测活.复性液中酶的终浓度为0.2 g/L.(a)复性时间为60 min(b)复性时间为24 h1.4 溶菌酶活性的测定圈1各种添加剂对溶菌酶复性影响以0.25 g/L微球菌(溶于60 mmol/L磷酸盐缓冲Fig.1 Lysozyme refolding in the presence液,pH =6.2)为底物测定溶菌酶活性.向1.5 mL底物of various additives溶液中加入0.1 mL一定浓度的溶菌酶复性液,测定反由图1可见，与自发复性相比,加入乙酰胺、丙酮、应液在450 nm下的吸光值变化,以2 min内吸光值的精氨酸及硫脲都可有效提高变性溶菌酶的复性收率.降低速率与100%酶活性相比即得相对酶活性(R、).实特别是精氨酸,复性1 h的复性收率可达80%,比自发验中考察了各种添加剂对测活的影响,未发现有干扰复性收率(48%)提高了30%以上.虽然加入丙酮,乙酰现象.胺在反应1 h的复性收率相对较小(60%和58%) ,并且加入硫脲的复性收率仅为40%(不及对照组的自发复2结果与讨论性)(图1a ),但延长复性时间至24 h, 复性收率均显著升高,尤其是添加丙酮时的复性收率可升至100%2.1不同添 加剂对溶菌酶复性的促进作用中国煤化工内某些相似基团可能对研究表明,高浓度的盐酸胍虽然是蛋白质的变性剂,但较低浓度的盐酸胍可很好地抑制肽链分子间的CN M H要虽然精氨酸能有效促心x江他马用如取问大时氨基酸(天冬酰胺与甘2004年7月董晓燕等:添加剂促进变性还原溶菌酶复性的作用●645●氨酸)不仅不能促进变性溶菌酶复性,反而使复性收2.3添加剂与盐 酸胍在促进溶菌酶复性中的相互率下降.同样,甘油能很好地促进溶菌酶复性,另两种关系结构相似的醇类物质(D -山梨醇和乙醇)没有促进复以上结果分析认为，与盐酸胍结构相似的乙酰性作用.说明只有与盐酸胍结构类似的物质,才可发挥胺、丙酮、硫脲及精氨酸对促进变性溶菌酶的复性作用抑制分子间聚集和提高复性收率的作用.甘油的作用可能与盐酸胍相同,而甘油则不同.为了进- -步探明不可能与其特殊的物化性质有关同添加剂与盐酸胍之间的相互作用,在较低盐酸胍浓2.2添加剂浓度对溶菌酶复 性的影响度(0.06 mol/L)下,进- - 步研究了5种添加剂浓度促从图1可以看出,添加相同浓度(1 mol/L) 的丙进变性溶菌酶复性的作用,如图3所示.酮、乙酰胺和硫脲虽然都能促进变性溶菌酶复性,但复性收率相差较大,因此认为各种添加剂可能存在最佳甘乙酰胺的浓度使复性收率最高.为探索各种添加剂的最佳的▲丙酮浓度,研究了以上5种有促进复性作用的添加剂浓度-口-精氨酸对变性溶菌酶复性的影响,结果如图2所示,其中R,0 tHd为活性收率,c,为添加剂浓度.x 40102心乙酰胺圄3较低盐酸胍浓度下添加剂浓度0F+丙酮对溶菌酶复性收率的影响--精氨酸.Fig.3 Additive concentration dependence of lysozyme+硫脲refolding with various additives in lowerconcentration of GdmCl°十26广8从图2和图3可以看出,在两种不同盐酸胍浓度團2添加剂浓度对溶菌酶复性收率的影响下,甘油浓度均达到3.2 mol/L时变性溶菌酶的复性Fig.2 Additive concentration dependence of lysozyme收率最高.当盐酸胍浓度为0.2 mol/L 时,复性收率达refolding with various additives80%(图2) ;盐酸胍浓度降至0. 06 mol/L 时,复性收率由图看出,在本实验条件下,5种添加剂均存在最只有40%(图3).与此相比，乙酰胺等其他4种添加剂佳浓度使变性溶菌酶的复性收率最大.除甘油外,其余最佳浓度值随盐酸胍浓度的降低而增大.例如，当盐酸4种添加剂均表现为随浓度的升高复性收率不断上胍浓度为0.2 mo/L时,复性收率达90%时的乙酰胺浓升,但当浓度升到--定值时,继续增大添加剂的浓度,度为2 mol/L;当盐酸胍浓度降至0.06 mol/L时,乙酰复性收率明显下降.此结果与盐酸胍浓度对溶菌酶复胺浓度需升至4mol/L才可获得同样高的复性收率.性收率影响的结果一致[1] ,说明这些添加剂的作用类此结果进-步证实了上述分析,说明不同添加剂对促似于盐酸胍,当浓度适当时能保护变性蛋白质伸展肽进变性蛋白质的复性作用不同.链和部分折叠片断的疏水基,有效抑制肽链间聚集促在Yasuda等人”的研究中,相同的盐酸胍浓度进复性;当浓度过高时,不仅抑制了肽链分子间的聚集下,添加1.4 mol/L和3 mol/L的乙酰胺获得了相同的作用,同时也抑制了分子内折叠,使复性收率下降.对溶菌酶复性收率(实验条件与本文相近) ,因此他们认于甘油而言,随着复性液中甘油浓度的升高,变性溶菌为,乙酰胺能抑制肽链间的聚集作用,但不影响分子内酶的复性收率虽然也随之升高,但当浓度升至- -定值的折叠.笔者的研究发现,乙酰胺、丙酮硫脲和精氨酸时(3.2 mol/L) ,继续增大浓度,复性收率不再明显变均存在最佳浓度使变性蛋白质的复性收率最高(图2化由此可见甘油与其他添加剂不同,甘油的存在可能和图3).该结果夷明:这些物质对促进变性溶菌酶的增大了天然态蛋白质在溶液中的热力学稳定性”,促复性作中国煤化工浓度过低时,变性蛋白质!Y台CNMHG效抑制，表现出较.进蛋白质复性反应向正确折叠的方向进行.●646●天津大学学报第37卷第7期低的复性收率;随着浓度的增大,分子间的疏水性相互参考文献:作用的抑制作用逐渐增强,因而复性收率不断升高;当添加剂浓度过高时,不但抑制了蛋白质折叠过程中的[1] Kurganov B 1. Kinetics of protein aggregation:Qutitaive es-分子间疏水作用，同时也抑制了分子内的疏水作用timation of the chaperone-like activity in test-systems based(折叠)，使复性收率转而下降.与此相比,甘油对溶菌on suppression of protein aggregation [ J]. Biochemistry(Moscow) , 2002, 67(4): 409- 422.酶复性虽有促进作用,但它没有抑制肽链间聚集的作2] Dong Xiaoyan, Wang Ying, Sun Yan. Kinetics of lysozyme re-用,仅是通过提高天然态溶菌酶的热力学稳定性,促进flling faitiated by arificial chaperones[J]. Journal of变性溶菌酶向天然态折叠.因此,在较低的盐酸胍浓度Chemical Eninering of Chinese Uniersities , 2002, 16(3):下单纯增大甘油浓度不能使复性收率明显提高,同时306--310( in Chinese).甘油不抑制溶菌酶分子内折叠,因为在较高甘油浓度3] Masahiro Y, Yumi M, Ayumu s, et al. Etect of aditives下继续提高甘油浓度,复性收率并无显著变化(见图2on refolding of a denaturated protein[J]. Biotechnol Prog ,与图3).1998, 14: 601- -606.综上所述,甘油和盐酸胍在促进变性溶菌酶复性[4] Goldberg M E, Rudolph R, Jaenicke R. A kinetic study of过程中具有协同的作用,即二者的作用是加成的.而乙the competition between renaturation and aggregation during酰胺等4种添加剂和盐酸胍促进变性溶菌酶复性的作the refolding of denatured-reduced egg white lysozyme[J].Biochemistry, 1991, 30; 2790- 2 797.用机理相同,即二者可以相互替代5] Shi Jinhui, Dong Xiaoyan, Sun Yan. Efeet of guanidiniumchloride concentration on the refolding of denaturated lyso-3结语zyme[J]. Acta Biochimica of Biophysica Sinica, 2001, 33(4): 447- 451( in Chinese).精氨酸、乙酰胺、丙酮、硫脲及甘油均能有效促进[6] Johannes B, lra P, UIrich B. A mehod for increasing the变性溶菌酶复性,并且都存在最佳的添加浓度使变性yield of properly folded recombinant fusion proteins : Single-溶菌酶的复性收率最大.但乙酰胺等盐酸胍类似物在chain inmunotoxins from rfolding of bacterial inclusion促进复性中,与盐酸胍具有相同作用,因而在降低复性bodies[ J]. Analytical Biochemistry, 1992, 205: 263- -270.液中盐酸胍浓度的同时,适当提高乙酰胺等浓度即可[7] Maeda Yoshitake, Yamada Hidenori, Ueda Tadashi. Efet获得较高的复性收率.而甘油与盐酸胍则存在协同作of additives on the refolding of reduced lysozyme in the pres-用,只有在- -定浓度的盐酸胍存在下,添加适量的甘油enceof4 M urea[J]. Protein Engineering, 1996,9(5):461- 465.才能获得较高的复性收率.中国煤化工MYHCNMHG