重组人睫状神经营养因子的聚乙二醇化修饰

ETTERS IN BIOTECHNOLOCY Vol.25 No.1 Jan., 201465doi: 10.3969/jissn. 10090002.2014.01.016研究报告重组人睫状神经营养因子的聚乙二醇化修饰梁凌宇,雷清,高雪峰,杨军,应莲芳,蒋琳兰州生物制品研究所有限责任公司,甘肃兰州730046[摘要] 目的:研究重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)突变体的聚乙二醇(PEG)化修饰,对rhCNTF的PEG化产物进行初步分离纯化及相关生物活性检测。方法:采用分子生物学技术经点突变得到rhCNTF的突变体CNo,通过实验设计研究CNo的最佳PEG化条件;采用分子筛层析方式对偶联产物进行初步纯化,最后用ELISA和小鼠体重增长抑制法检测PEG化后的CNo蛋白的生物活性。结果:能运用mPEG-MAL对CNu进行定点修饰, PEG化后用Superdex200能够分离CNo;PEG化后的CNo每2 d腹腔注射1次,对小鼠体重的增长抑制率可达50%,与rhCNTF每天注射2次的体重增长抑制作用相当。结论:CNo蛋白在PEG化修饰后,其减重效应持续时间明显延长。[关键词]人睫状神经营养因子;聚乙二醇化修 饰;纯化;体重增长抑制[中图分类号] Q78; Q502[文献标识码] A[文章编号] 1009-0002( 2014)01-0065-03PEGylation of Recombinant Human Ciliary Neurotrophic FactorLIANG Ling-Yu, LEI Qing, GAO Xue-Feng, YANG Jun, YING Lian-Fang, JIANG Lin*Lanzhou Institute of Biological Products Co. Ltd, Lanzhou 730046, China*Corresponding author, E-mail: jianglin620@ sohu.com[Abstract] Objective: To study the PEGylation of recombinant human ciliary neurotrophic factor( rhCNTF)，estab-lish the preliminary separation and purification of the polyethylene glycol- modified rhCNTF, and then to detect thebiological activity of PEGylation rhCNTF. Methods: Using molecular biology techniques to obtain the mutants CNoof rhCNTF by point mutation, then to study the conditions of PEG conjugation by design of experiment. The prod-uct of PEGylation rhCNTF were purified by molecular sieve chromatography, finally the biological activity were de-tected by ELISA and the method of weight loss in normal mouse. Results: CNo can be successfully fixed- pointmodified by mPEG- MAL, the weight loss in mice experiments showed that the weight inerease inhibitory rate ofPEGylation CNo were u to 50% when received an intraperitoneal injection every other day, it was equivalent toinhibitory efct of rhCNTF which injected twice a day. Conclusion: Afer PEG modification, the biological effectof rhCNTF was significantly prolonged.[Key words] recrecombinant human ciliary neurotrophic factor; PEGylation; weight increase inhibition; purification聚乙二醇(PEG)修饰是20世纪70年代后期逐因工程重组产品。药效学实验证明, rhCNTF皮下注渐发展起来的一-项热门]技术",目前已用于多种蛋白射(sc)时对大鼠高营养性肥胖和糖尿病合并肥胖模质及多肽类药物的修饰。蛋白质药物经PEG修饰型均有明显的减肥作用,临床上拟用于治疗肥胖后,最显著的优点就是延长了体内半衰期,从而可降症。但是,rhCNTF的体内半衰期较短,临床应用时低给药频率,以减轻药物的毒副作用”;同时,由于须每天注射,长期用药会增加患者的痛苦。基于此，PEG本身不具备免疫原性,PEG化后,PEG有可能遮我们尝试采用PEG对巯基修饰的方法来修饰盖蛋白质表面的抗原决定簇,从而可降低免疫原性rhCNTF,根据相关文献4,用定点突变法在蛋白质中和抗原性”。因此，蛋白类药物在PEG修饰后可增引人半胱氨酸,以mPEG-MAL作为聚乙二醇化试强其在临床上的治疗指数,扩大临床使用范围。本剂,通过把蛋白质上的巯基加成到mPEG-MAL的双研究室研制的重组人睫状神经营养因子(recombi-键上而实现对蛋白质的定点修饰。此法已在许多蛋nant human ciliary neurotrophic factor , rhCNTF)是白质的聚乙二醇化修饰中取得了良好的效果,其关一种在CNTF天然序列的基础上经过改造得到的基键在于选择合适的修饰位点,以避开蛋白质的活性位点。本研究迷气严中国煤化工J rhCNTF突作者简介:梁凌宇(1978- ), 男,助理研究员收稿日期:2013-05-02变体CNo,并采THCNMH 流基进行定通信作者:蒋琳, ( E-mail)jiangin620@sohu.com量定点修饰,对5U10江力网纯化后进行56LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol.25 No.1 Jan, 2014相关生物活性检测,以得到符合预期效用的rthCNTF1.5 CN:o与mPEG-MAL的结合及结合蛋白的纯化长效化蛋白。在8C条件下将CNo蛋白透析至PB缓冲液(50mmol/L, pH6.8)中进行结合实验,选择CNi的初始浓1材料与方法度为1 mg/mL, 物料比为1:1,反应24 h后采用10kD超滤膜对反应混合液浓缩至1/4,取2 mL浓缩液上1.1 材料样Superdex 200( 16/60)柱,280 nm波长进行监测,昆明鼠由本公司实验动物室提供;大肠杆菌收集第一峰,分别用HPLC和SDS-PAGE检测PEGBL21(DE3)、含rhCNTF基因(558 bp) 的重组质粒化CNw结合蛋白的纯度。pET/rhCNTF由本室保存;Taq酶.T, DNA连接酶及1.6结合蛋白的活性检测限制性内切酶Nde I、Aur II均购自TaKaRa公司;胰1.6.1 ELISA活性 采用双抗体夹心法,抗体为- -蛋白胨、酵母提取物购自Oxiod公司;PCR引物由上对抗rhCNTF单抗。将CNio结合蛋白及rhCNTF阳性海生:工生物工程公司合成;mPEG- MAL 20kD购自对照分别用生理盐水稀释至1 μg/mL后再稀释6个北京健凯科技有限公司;层析介质来自GE-Health-梯度,以100 μL/孔加入96孔板进行检测。care公司;其他生化试剂均为国产分析纯产品。1.6.2小鼠体内活性试验采用小鼠体重增长抑制PCR扩增仪PTC-200为BIO-RAD公司产品;凝胶扫法。将昆明鼠随机分为3组,I组为生理盐水,2组为描成像系统ImageQuantVDS、层析系统AKTAex-CN1o原液,3组为CNo-mPEG-MAL,按100 μg/kg 剂plorer为GE公司产品。量肌肉注射1针后每天称量小鼠体重,按下式计算1.2 CNi突变体的构建5 d小鼠体重增长抑制率!:以含人工合成的rhCNTF基因的重组质粒pET/5 d小鼠体重增长抑制率(%)=rhCNTF为模板设计上下游引物，经点突变在对照组5d平均体重-给药组5d平均体重x100%对照组5d平均体重rhCNTF基因中引人一个半胱三酸位点,扩增出突变基因CNo,经Nde 1、Aor II双酶切后用T, DNA连接2结果.酶插人经同样酶切处理的质粒pET42b,以此连接物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,涂布含卡那2.1重 组pET/CNo质粒的酶切鉴定霉素的LB平板,37C培养过夜,挑取单克隆菌培养突变重组体pET/CNo质粒经Nde I、Aor II双酶提取质粒,经PCR、酶切判定阳性质粒,将获得的阳.切后产生一.条约560bp的目的基因片段和一条约性突变重组体记作pET/CNroo5500 bp 的载体片段,与理论结果相符(图1)。1.3 突变体pET/CNo在大肠杆菌中的表达挑取阳性单克隆菌,接种于3 mL LB(含卡那霉2.2 CN。在大肠杆菌 中的表达及纯化素)液体培养基中,37C培养至Dom为0.6时加入终将诱导6 h的CN。菌液进行SDS-PAGE,结果显浓度1mmol/L的IPTG诱导,继续培养4h后离心收示目的蛋白表达量约为40%,相对分子质量约为21x10*(图2)。离心收集菌体并超声波破碎,包涵体集菌体,SDS-PAGE检测CN。的表达水平。经变性溶解后透析复性,G25脱盐后用Qsepharose1.4 CNu的纯化挑取表达量较高的阳性菌株放大至2000 mL体FF阴离子交换柱进行纯化，梯度解离,收集目的蛋积三角瓶培养,以终浓度1 mmol/L 的IPTG诱导,离白,电泳扫描分析,纯度可达95%以上(图2)。心收集菌体,所得湿菌体用TE重悬,超声波破碎,所.3 CN,与mPEG-MAL的结合及结合蛋白的纯化得包涵体蛋白经变性、透析复性、SephadexG25脱分别取反应4和24h的样进行SDS-PAGE,结.果显示,反应24 h后,经VDS扫描分析,结合物的比盐、Q Sepharose FF等层析步骤进行纯化。M(x10)_ M_ 1 23 4 M M(x10)97.244.0200044.29.09505020.120251014.3. . _4.3中国煤化工图1 pET/CNw的双酶切图谱THCNMH GM:DL2000 DNA marker; 1:pET/CNo的Nde I .Aur II双酶切片段M:蛋白质marker; 1,2:CNm培养菌液;3,4:纯化的CNn蛋白梁凌宇等:重组人睫状神经营养因子的聚乙二醇化修饰6°例可达70%。反应混合物经Superdex200纯化后,PEG连接位点的选择,除此之外,修饰条件和副产物结合蛋白纯度可达95%以上。结果见图3 .4。的产生也会影响到蛋白的生物学活性。因此,选择2.4CNo修饰产物的活性检测合适的修饰位点和修饰方法就显得至关重要。本实2.4.1 ELISA 活性CNo- mPEG- MAL的ELISA活验室正在开展的rhCNTF的PEG化工作选择巯基修性可达1:4000, rhCNTF阳性对照为1:16 000, 而饰是基于rhCNTF本身的特点,rhCNTF分子内无二CNn原液可达1:32 000。结果表明CNo在PEG化后硫键,也无糖基化位点,因此在实验设计之初就考虑ELISA活性明显降低,与设计预期相符(表1)。在远离生物活性位点处引人半胱氨酸,以达到对2.4.2小鼠体内生物活性小鼠肌肉注射CNo-rhCNTF的定点修饰。初步实验结果表明,rhCNTFmPEG-MAL后48h内体重增长抑制明显,体重增长的突变体CNo可成功地经mPEG-MAL进行修饰,引抑制率可达50%,和CN。原液注射组相比有显著差人一个半胱氨酸残基之后,CNo的生物学活性无明异,5 d后CNn0-mPEG-MAL肌肉注射组体重增长抑显降低,在PEG化修饰后,修饰产物也保留了较好的制率可达25%。结果表明CNu在PEG修饰后减重持生物学活性,生物学效应明显延长,实验结果比较符续时间和体内半衰期明显延长(图5)。合设计预期。有关rhCNTF在PEG化后的体内半衰期和免疫原性的准确评价,还有待更进一步的药代45.MM(x103)动力学研究才能确定。. 97.2表1 PEG-CNw的ELISA检测结果44.0CNo- mPEG- -MAL 0.262 0.199 0.116 0.058 0.039 0.03529.0rhCNTF标准品0.651 0.576 0.357 0.167 0.068 0.042CNw原液1.553 1.468 1.374 1.134 1.117 0.751阴性值0.036 0.041 均值 :0.0385.14.3图3 PEG-CNw的 SDS- PAGE分析+生理盐水对照M:蛋白质marker; 1:纯化的PEG-CNo;2:反应4 h的样品;3:反应24 h完成后的样品;4,5:CNo单体e‘4- CN1o原液f- + PEG- CN1ot图5 PEG-CNu的小鼠减重实验结果参考文献图4 PEG-CNw的 RP-HPLC分析A相:含0.1% TFA的注射用水;B相:含0.1% TFA 的乙腈1] Inada Y, Furukawa M, Sasaki H, et al. Biomedical and bio-technological application of PEG- and PM- modified proteins3讨论小Tibtech, 1995,13:86-91.2] Veronese F M. Peptide and protein PEGylation: a review ofproblems and solut ions[J]. Biomaterials, 2001 22:405-417.PEG化技术是一种非常有效的药物长效化技3] Woghiren C, Sharma B, Stein S. Protected thiolpolyethylene术,可用来解决或缓解蛋白质和多肽类在药用过程glycol: a new activa ted polymer fo reversible protein modif-中存在的诸多问题,比如半衰期短、存在免疫原性eation[J]. Bioconjugate Chem, 1993,4:314-318.等。但是,PEG化修饰的同时也可能会降低生物学4] 王良友,刘克良.多肽和蛋白质的聚乙二醇化修饰方法[].有活性,这也是PEG修饰面临的最大难题。导致蛋白机化学, 203211);1320-1323.的生物学活性降低的原因是多方面的,最主要的是5] 毕华，袁力勇，史新昌,等睫状神经营养因子突变体蛋白的活性研究[J].中国生物工程杂志, 2007,27(1);1-5.中国煤化工MHCNM HG