唐古特大黄乙醇提取物的HPLC指纹图谱研究

第25卷第11期分析试验室25 No 11006年11月Chinese Journal of Analysis Laboratory唐古特大黄乙醇提取物的HPLC指纹图谱研究周剑波2,蒋福全2,文怀秀12,邵赟,师治贤,陶燕铎*〔Ⅰ.中国科学院西北高原生物研究所,西宁810008;2.中国科学院研究生院,北京100049)摘要闱高效液相色谱法建立唐古特大黄乙醇提取物的指纹图谱分析方法。采用 Phenomenex Kromasil C色谱柱(4.6mm×250mm,5pm);甲醇-0.1%HPO为流动相,梯度洗脱,检测波长为270nm,以大黄酸为参照峰。结果共有18个共有峰。此法为有效地控制唐古特大黄乙醇提取物的质量提供了依据.关键词唐古特大黄;提取物;HPLC;指纹图谱中图分类号657.7文献标识码A文章编号1000-07202006)1-001-05唐古特大黄( Rheum tanguticum Maxim.ex器), agilent化学工作站,中药色谱指纹图谱相似Ba∥f.)为蓼科植物,是大黄药材的主要来源,其有度评价系统(国家药典委员会,版本2004A),KQ效成分主要是蔥醌类衍生物如大黄酸、大黄素、-250DB型数控超声波清洗器(昆山市超声波仪器大黄酚、芦荟大黄素和大黄素甲醚等,具有泻热有限公司),电子分析天平(梅特勒公司通肠,凉血解毒,逐淤通经等功能,是中医临床1.2试剂常用中药。有关大黄中蒽醌类衍生物的含量测定甲醇为色谱纯(山东禹王化工厂),水为重蒸方法报道24较多,但以此作为质量控制,很难全水,其它试剂均为分析纯。大黄酸对照品(批号面反映药材或提取物的内在质量。而有关大黄指0757-9804)大黄素对照品(批号:110756纹图谱的研究,文献5也曾有报道,但多限于200110)大黄酚对照品(批号:110796-200309大黄药材成份的指纹图谱分析。徐雄良等曾研大黄素甲醚对照品(批号:758-9301),以上对照究了注射用大黄粉针剂的HPLC指纹图谱,关于大品购自中国药品生物制品检定所。12批唐古特大黄提取物的HPC指纹图谱还没见报道。建立中药黄乙醇提取物由本实验室根据优化工艺制得。提取物可行的质控方法将更加有助于中药提取物2方法与结果向更广阔的国际市场空间发展。利用色谱指纹图2.1色谱条件谱可以较为全面地检测其多种成分在药材中分布Phenomenex Kromasil C1色谱柱(4.6mm×250的全貌,使药材的内在质量情况可视。本文通m,5pm);流动相:A相为甲醇,B相为0.1%的过优选HPLC梯度洗脱程序,建立了大黄乙醇提取H3PO缓冲液,采用梯度洗脱∶流速:1.0mI/r物的指纹图谱质量控制技术,可作为唐古特大黄DAD检测器,柱温30℃。线性梯度洗脱程序见乙醇提取物及以其为主成分制剂的指纹图谱研究表1,运行时间50min,两次进样之间用流动相初基础始梯度条件平衡15min。采用二极管阵列检测器1仪器与试剂对检测波长进行了考察,分别记录波长在2301.1仪器254、270、280,300mm的色谱图。结果在270mmΔ gilet100液相色谱仪〔含在线真空脱气机,处各色谱峰均有较好的紫外吸收,色谱信息最为低压四元梯度泵,手动进样器,柱温箱,DAD检测丰富,并且分离度好,可使主要色谱峰达到基线*收稿日期:2006-02-24修订日期:2006-04-29基金项目:中国科学院知识创新工程(CXLY-2002-9项目资助第25卷第11期分析试验室ol.25.No.112006年11月Chinese Joumal of Analysis Laboratory2006-11分离。以大黄酸色谱峰(指纹图谱中为14号峰)为参照表1线性梯度洗脱程序峰,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。Gradient elution program结果表明,各共有峰相对保留时间和相对峰面积梯度流速B/%稳定,RSD<3%,表明样品溶液在16h内稳定。t/min(ml/min)甲醇0.1%HPO4缓冲液2.4唐古特大黄提取物指纹图谱的测定及参数分别准确吸取对照品溶液及12批供试品溶液各10μL按前述色谱条件进样,记录指纹图谱(见图1、图2),将图谱数据导入指纹图谱相似性评价软(中药色谱指纹图谱相似度评价系统,2004A2.2样品与对照品溶液的制备版)分析,通过设置参照图谱,自动匹配(见图3),2.2.1提取物的制备根据文献"报道,经过生成对照图图2)确定了18个共有峰,其中14优化确定提取物的最佳提取工艺为唐古特大黄药材粉碎成粗粉,加8倍量V75%乙醇):V(15%384.9H2SO4)=10:1回流提取2次,每次2h,合并提取液,浓缩,先用乙酸乙酯萃取,乙酸乙酯层再以50g/ L NaoH溶液萃取,取水层,加入HCl后得沉淀,干燥成浸膏粉,得提取物。2.2.2样品溶液的制备准确称取干燥至恒量的09.1618.3227.4836.6445.805496提取物粉末10mg,加甲醇超声溶解,用甲醇定容图1混合对照品色谱图至25mL,过0.45m的微孔滤膜后作为供试品溶Fig. I Chromatogram of mixed reference substances液大黄酸;b-大黄素;c-大黄酚;d-大黄素甲醚2.2.3对照品溶液的制备分别准确称取大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚对照品5mg,加384.91甲醇超声溶解,用甲醇定容至25mL,制成0.2mg/m的混合对照品溶液,过0.45{m的微孔滤膜后作为供试品溶液。2.3方法学考察2.3.1精密度分别准确吸取同一供试品溶液0△10μL,按上述色谱条件连续进样5次,记录指纹09.1618.3227.4836.6445.8054.96图谱。以大黄酸色谱峰(指纹图谱中为14号峰)为图2对照样品色谱图参照峰,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰Fig 2 Chromatogram of a representative sample面积。结果表明,各共有峰相对保留时间和相对峰面积稳定,RSD<3%,表明仪器精密度良好。15、16、18号峰分别为大黄酸、大黄素、大黄酚2.32重现性按样品溶液制备方法处理同一样大黄素甲醚,选取14号峰大黄酸为参照峰标示品5份,各吸取10L,按上述色谱条件分别测定为S峰)计算各共有峰对保留时间和相对峰面积记录指纹图谱。以大黄酸色谱峰指纹图谱中为14值分别见表2、表3单峰面积与总峰面积的比号峰)为参照峰,计算各共有峰的相对保留时间值大于10%的共有峰有1、4、5、14号峰,其相对和相对峰面积。结果表明,各共有峰相对保留时保留时间分别为0.104、0.346、0.434、1.000.间和相对峰面积稳定,RSD<3%,表明实验方法用夹角余弦法计算相似度,进行整体相似度评价,的重复性良好,通过相似度分析发现,12批样品的相似度均在23.3稳定性取同一供试品溶液分别在0、2、95%以上(见表4),平均为97.5,表明样品相似性L良好,可以作为控制唐古特大黄乙醇提取物的质第25卷第11期分析试验室25 No 11年11月Chinese Journal of Analysis Laboratory2006-11量依据。384.91大黃酸大黄素大黄酚大黄系甲醚8910121317人凡A水术法18.3236.64图312批大黄提取物样品的匹配色谱图Fig 3 Matching chromatograms of 12 batches of rhubarb extracts表212批大黄提取物指纹图谱共有峰相对保留时间(t/min)Tab 2 Relative retention values of characteristic peaks for 12 batches of rhubarb extracts批号峰号12平均RSD/%10.1030.1020.1040.1050.1030.1010.1040.1050.1020.1040.1030.1060.1041.39720.1270.1260.1250.1240.1270.1240.1270.1250.1260.1250.1240.1250.1250.92930.1850.1830.1840.1860.1850.1860.1830.1840.1850,1860.1840.1820.1840.71140.3480.3460.3450.3470.3450.3430.3450.3470.3490.3460.3440.3470.3460,49350.4340.4320.4350.4330.4360.4310,4340.4360.4320,4340.4330.4350.4340.36960.5410.5430.5380.5370.5390.5420.5430.5400.5390.5440.5420.5410.5410.40370.6780.6750.6730.6760.6740.6790.6770.6760.6750.6740.6740.6760.6760.26480.7450.7430.7470.740.7420.7460.7450.7440.7430.7450.7460.7470.7450.2157850.7830.7860.7870.7820.7850.7880.7860.7870.7820.7840.7830.7850.260100.8210.8240.8180.8170.8250.8230.8220.8240.8250.8200.8250.8230.8220.333ll0.8400.8420.8370.8420.8430.8410.8440.8410.8430.8450.8460.8440.8420.288120.8800.8770.8810.8820.8780.8850.8830.8780.8790.8830.8810.8770.8800.29630.9490.9470.9450.9530.9510.9480.9530.9470.9520.9460.9490.9470.9490.28914S)1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000151.2951.2921.2951.2931.2961.2941.2911.2971.2951.2981.2921.2911.2940.179161,4201,4191.4221.4211,4241,4221,4171.4211.4231,4181.4201.4211,4210.142171.4871,4851,4901,4881.4911.4861.4881.4911,4851,4871,4851.4861.4870.150181.5711,5741,5691.5731.5681,5721.5721.5681.5731.5671.5721.5691.5710.149第25卷第11期分析试验室ol.25.No.112006年11月Chinese Joumal of Analysis Laboratory2006-11表312批大黄提取物指纹图谱共有峰相对峰面积Tab 3 Relative peak areas of characteristic peaks for 12 batches of rhubarb extracts批号峰号12平均RsD/%11.1091.1001.1071.1051.1071.1091.1071,10l121.1071.1091.1051.1070.26520.3310,3370.3400.3340.3320,3300.3280.3290,3340.3380.3300.3360.3331.16030.3750,4010.3800.3780.3850.3730.3710.3760.3810,3810.3730.3790.3792.08641.3921.4031.3891.3971.421.3951,3931.3981.3941.4021.3951.3951.3980.59350.9100.9080.9130.9120.9080.9060.9010.9060.9080.9110.9060.9130.9090.38860.2400.2370.2430.2420.2370.2370.2390.2390.2370.2350.2370.2420.2391.05870.2320.2390.2370.2370.2400.2320.2350.2360.2360.2370.2310.2330.2351.22180.1580.1620.1550.1610.1570.1590.1540.1560.1580.1570.1560.1550.1571.54190.1920.1980.1980.1950.1920.1890.1850.1930.1970.1910.1920.1940.1931.964100.1280.1300.1250.1290.1270.1270.1250.1260.1280.1240.1280.1250.1271.459110.2970.2910.2950.2930.2980.2960.2930.2920.2940.2910.2960.2940.2940.778120.1610.1580.1630.1590.1570.1590.1600.1620.1610.1600.1600.1630.1601.164130.1860.1870.1890.1910.1850.1850.1840.1870.1890.1890.1850.1860.1871.15141.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.00050.3340.3340.3330.3360.3340,3330.3310.3340.3340.3350.3330/3300.3330,486160,1020.1020.1010.1030.1040,1040.1010.1020.1050.1020.1040/1060.1031.549170.1350.1400.1390.1420.1410.1330.1360.1380.1410.1420.1330.1410.1382,435180.0410.0400.0400.0410.0420.0400.0420.0410.0400.0410.0410.0400.0411.850表412批大黄提取物的相似度烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相柱,分别对甲Ib4 Similarity analysis results of I2 batches of rhubarb醇-水、甲醇-0.1%H3PO、乙腈-水和乙腈extracts0.1%H3PO等体系进行了等度和梯度洗脱试批号相似度批号相似度验,结果以甲醇-0.1%HPO水体系进行梯度洗0.9810.980脱得到的色谱峰形以及分离度较好;比较了1900.9770.975400mm波长下的色谱图,结果270mm波长时色谱0.9520.961峰信息较多,分离情况良好;同时考察了不同柱0,9860.981温、不同流速等条件对色谱分离的影响,表明柱0.978110,984温30℃,流速ImL/min为佳,采用本方法可使主0.9830.964要色谱峰在50min内达到很好的分离,且同时分析了大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚4个指讨论标成分,这使提取物的指纹图谱分析效率大大提1.本实验依据国家药典委员会关于《中药注。射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》,以HPLC通过本方法分析12批唐古特大黄的乙醇梯度洗脱法对唐古特大黄的乙醇提取物进行了指提取物,经指纹图谱相似度软件分析,相似度均纹图谱研究,实验证明,该方法可操作性强、重复在95%以上。所建立的方法精密度、稳定性和重性好,可作为唐古特大黄乙醇提取物及以其为主现性符合指纹图谱研究的技术要求,为唐古特大成分制剂的指纹图谱研究基础。黄乙醇提取物及其制剂的质量控制提供了科学依第25卷第11期分析试验室25 No 11006年11月Chinese Journal of Analysis Laboratory参考文献2004,354):559[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(第一部)[9]张立新,周晓英等.药品检测,2001,1010):36北京:化学工业出版社,2000.18[10]刘欣,胡芳弟等.分析测试技术与仪器,2004,10[2]华晓东,王智华等.中成药,2002,245):340(3):140[3]李太平,王小文等.中成药,2003,234):293[11]徐雄良,张志荣,黄园.色谱,2003,216):596[4]曹红,刘云.药物分析杂志,1998,181):3[12]谢培山.中国中药杂志,2001,2610):6535]陈斌,蔡宝昌等.中草药,2003,345):457[13]裴月湖.天然药物化学实验,北京:人民卫生出版[6]朱玲英,任爱农等.中成药,2003,256):438社,2005:141[7]秦晨,段玉萍等.现代仪器,2000,(3):8[14]郑志华.广东药学,2002,1x(3):58[8]徐雄良,张志荣,黄园.四川大学学报(医学版)Study on HPLC fingerprint of alcohol extracts from Rheum tanguticumZHOU Jian-bo.,JIANG Fu-quan, WEN Huai-xiu, SHAO Yun, SHI Zhi-xian and TAO Yan-duo(1. Northwest Institute of Plateau Biology, Chinese Academy of Sciences Xining 810008; 2. Graduate School of Chinese Academy of Sciences Beijing 100049), Fenxi Shiyanshi, 2006, 25( 11): 1-5Abstract: Fingerprint chromatograms of alcohol extract from Rheum tanguticum by HPLC were established. A Phe-nomenex Kromasil CI8( 4. 6 mm x 250 mm, 5 um)column was used methanol-01% phosphate acid was used asthe mobile phase and gradient elution program was used, UV detection wavelength was 270 nm, and rhein was usedas a reference peak. The results indicated that 18 peaks were obtained in fingerprint chromatograms. The method issimple and accurate with a good reproducibility and it can be used as a quality control method for alcohol extractseum tKeywords: Rheum tanguticum Extract Fingerprint chromatogram i HPLC全国试剂与应用技术交流会会议通知(第二轮)为总结、交流化学试剂包括小吨位精细化学品)与应用技术、分析测试技术的进展交流最新成果搭建产、学、研、销用平台促进化学试剂和分析测试技术的发展中国分析测试协会、全国化学试剂信息站将于2006年11月12-17日在海南省海口市海外酒店召开″全国试剂与应用技术交流会”具体由《化学试剂》编辑部承办。会议期间除发表论文外还有科技部条财司领导、中国科学院院土、著名专家、学者的专题报告。会议时间:2006年11月13日至17日报到时间:2006年11月12日全天会议地点:海口市海外酒店报名方法:欲參加会议者请填写回执寄回或传真给全国化学试剂信息站或《化学试剂》编辑部。为了安排食宿方便请务必于9月25日前寄回或传真回执联系电话:010-65283411、65281741;传真:65281741《化学试剂》编辑部010-68512289中国分析测试协会谢小E-mail:webmaster@chinareagent.com.cn通讯地址:100010北京市东城区东四南大街160号《化学试剂》编辑部中国分析测试协全国化学试剂信息站年7月20日