RNAi功能及应用

中外医疗漂EGN MEDICAL TREATM∈NT基础医学RNAi功能及应用0林健泽李振字(南方医科大学附属深圳市第二人民医院脊柱外科广东深圳518035)【摘要】RNA干涉( RNA interference,RNAi)是将双链RNA( dsRNA)导入蛔胞引起特异基因mRNA降解的一种蛔胞反应过程,它是转录后蕙因沉默(PIGS的一种这一过程已经在包括拟南芥线虫和真菌等多种模式生物中得到揭示RNA具有高效性和高度特异性,在维持基因蛆稳定基因表达调控保护基因蛆竟受外源橄酸侵入等方面发挥重要生物学作用。RNAi作为基因沉默的一个工具,RNAi作为基因沉默的一个工具,已被广泛用于基因功能研究基因治疗和新药研究与开发等方面【关键词】RNA干涉小干涉RNA基因沉默【中图分类号】Q421:R338文献标识码】A【文章编号】1674-0742(2009)03(c)-0012-03RNAi研究的历史过程等用 dsRNA转染未经 dsRNA处理过的果蝇胚胎细胞的提取物,1990年, Jorgensen和Mol领导的研究小组在研究牵牛花合成全程监测在这一无细胞体系中以放射标记的 dsRNA和mRNA变色素基因时,偶然发现在向牵牛花转导色素合成基因时,不仅是化,结果发现,不论mRNA是否存在, dsRNa都被分解成21转入的基因未表达,而且自身的色素合成也减弱了。相似的现象23nt的小片断,而且不论标记 dsRNA的正义链或反义链,都可检还发生在真菌的研究中,当把合成类胡萝卜素的基因转入到红色测到这些小分子RNA的存在,说明 dsRNA的两条链均发生断裂面包霉中时,却导致大约30%转染细胞自身基因的失活,研究者当只有在特异性 dsRNA存在的条件下mRNA才被降解,而且断裂时把这种现象称为“抑制( cosuppression)”,1995年Guo等在利的位置仅限于 dsRNA的相应的序列,将其分成21~23nt的片断用反义RNA技术研究秀丽新小杆线虫( C elegans)的par-1基因提示靶mRNA的断裂是以 SiRNA作为模板的。更为详尽的实验功能时发现,将与目的基因mRNA互补的反义RNA导入线虫细表明,RNA降解过程涉及两个步骤-9,第一步是双链RNA被名胞,能够阻断par-1基因的表达,但是奇怪的是,注入正义链RNA为 Dicer的核酸内切酶Ⅲ( RNase Ill)样蛋白加工成21-~25nt长度作为对照,也同样阻断了基因的表达。这一奇特的现象直到3年的 siRNA。第二步,反义链RNA引导核酸内切酶复合体(RSC)去后才被阐明,1998年Fire等发现这种现象是由于在制备正义/切除单链的同源mRNA.RISC在 SiRNA的引导下,切断序列特反义RNA时混入了少量的 dsDNA,他们将unc2,feml、hhl、异性的mRNA,切断部位大约在与反义小干涉RNA配对序列的myo3、gfp等基因的正义RNA、反义RNA、, dsRNA分别注射到中部,而后,mRNA进一步降解线虫中,发现 dsRNA所引起的基因沉默效应要比单个正义RNA2.2RNA介导同源DNA甲基化(RdDM)RNA或者反义RNA都要强的多,如果将制备的RNA纯化,正义RNA目前认为RNAi在细胞内发挥作用主要包括扩增和催化反应引起的基因沉默就会消失,反义RNA引起的基因沉默也会变得两个主要步骤。而在植物中,发现RNAi也能引发DNA甲基化,很微弱。他们把这种 dsrna介导的转录后基因沉默现象称为从而导致转录沉默现在证明sRNA可能通过直接DNA甲基RNAi。后来的实验表明 dsrNA不单可以特异性阻抑靶基因表化和在其他一些基因组中的共价修饰来完成转录过程。在植物达,而且还会导致其第一代子代的同源基因沉默。中,这一活性可能由另外一类 SiRNA介导完成。介导同源DNA2RNAi的作用机制序列中胞嘧啶甲基化作用,需要在PTGS/RNA中引导同源RNA虽然遗传学和生物化学方法已用于探索RNAi的机制,但真降解的sRNA的产生,只有与引导RNA序列互补的DNA序列才正的机理目前尚未明了,下面是RNAi的一些可能机制能被修饰,表明RNA与DNA直接发生相互作用。短至30bp的2.1 siRNA介导同源RNA降解DNA序列能够作为甲基化的目标,胞嘧啶是甲基化位点,且在胞1999年, Ham ilton等在植物基因沉默的研究中发现,21~浆中产生的诱导PTGS的RNA能从细胞质进入细胞核,产生对细5nt的 dsRNA的出现对转基因导致基因沉默十分重要,而在转基胞核的反馈作用,激发同源DNA的甲基化,这种RNA指导的因正确表达的植物中则未出现。随后, Hammond5和 Tuschl等6DNA甲基化扩大了原来有限的甲基化,从而进一步加强了基因沉也进行了相关实验研究证明了这些小分子RNA在RNAi中的作默。研究证实RdDM可能在启动或维持基因沉默中起作用,DNA用。因此提出了RNAi的模式:即 dsRNA被处理加工产生出21~甲基化缺陷将引起PTGS缓解。RNA触发RdDM可能与DNA甲23nt的RNA,后者通过序列互补介导mRNA的剪切降解。另MYH中国煤化工部分解链的DNA以形成实验进一步证实了 siRNA在RNAi过程中的存在和作用。 Zamore RNCNMHGRNA2DNA三分子螺旋①基金项目:深圳市科技计划项目(200602043)12中外医疗 CHINA FOREIGN MEDICAL TREATMENTCHINA FOREIGN MEDICAL T提中外医疗基础医学这些异常结构可能吸引 MTase靠近,经过充分循环,催化同源显微注射、浸泡或喂养的方法导入线虫,然后用解剖显微镜或微DNA甲基化1-12l最近有报道,在粟酒裂殖酵母( s Pom be)中分干涉差显微镜观察RNAi表型变化, ahringer)小组应用喂食RNAi机制在合成和维持高度有序的染色质结构与功能中发挥至的方法完成了预测基因86%的RNAi分析。 Hyman小组根据染色关重要的作用。缺失RNAi过程中关键基因导致中心粒DNA和体I的每个可读框,用PCR扩增基因组片段,将合成的 dsRNA其他类型的异染色质的表观遗传沉默现象缺失。这些改变伴随注射入线虫体内诱导了系统的RNA反应,并记录了胚胎突变表着有这些区域的甲基化状态改变进而中心黏合作用丧失导致核型。Pano和 Kemphues小组分析了350个卵细胞cDNA基因,其分裂过程中染色体的错误分离。有研究者据此提出理论解释了中81个基因在胚胎生成中有重要作用。在野生型细胞中,中心粒重复序列的表达导致 dsRNA甲基化。也3.2基因治疗有报道 SiRNA介导染色体结构跟大的改变,在四膜虫中程序性基RNAi的作用具有高效率和高特异性的特点,它能使目标蛋因组重排导致特异性DNA序列的切除白的mRNA发生特异性的降解。因此,RNAi是基因沉默疗法的23RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)模型理想工具。目前,人们已经证明在培养的哺乳动物细胞中,RNAiDNA甲基化能引起转基因转录的提前终止,从而产生异常可用于抗病毒和抗肿瘤等的基因治疗及神经系统疾患的治疗。RNA,转基因在细胞核中表达也导致了高水平的异常RNA转录。 Novena等发现,转染针对CD4受体合成的 SiRNA能使HV-1感当异常RNA的量超过一定阈值时,就会被存在于细胞质中的某染Magi-CCR5细胞的能力降低75%沉默gag能使p24表达下降体系所感知并激活细胞质中的RdRp,于是RdRp以异常RNA75%,nef- sirna则能使nef转录产物减少为原水平的10%,p24水为模板转录出小片段互补DNA(cDNA),这些cD2NA与核糖核酸平下降为原水平的4%。这些实验都能大大降低游离病毒水平。酶形成一个序列特异的复合物RISC,CDNA处于复合物的中心。 Brisibe等指出,在HIV-1基因组中nef基因可能是最重要的调该复合物能与mRNA杂交,捕获并降解与转基因序列相同或互补控基因。Nef是HⅣ早期表达产物,几乎占早期mRNA的80%,作的RNA,从而成为专一性作用于双链RNA的RNA降解酶底物,用包括下调CD4、细胞凋亡、信号转导和非CD4细胞萎缩,与引起低水平转基因RNA的积累。体外实验证明该酶能以RNA为LTR有一定重叠。Xia等用重组腺病毒相关病毒(AAV)对转基因模板合成cDNA,他们在体内杂合到相应mRNA上,并被特异作小鼠进行脑内注射, shrnA使SCA1小鼠蒲肯野细胞中异常用于双链RNA的RNA降解酶降解。 RdRp cDNa模型可以很好 ataxin蛋白和其mRNA降低了50%~60%, Calbi2ndin染色显示神地解释PTGS很强的序列特异性。非正常RNA能作为RdRp的经元死亡大大减少,核内 ataxin包涵体减少50%,且 rotarod运动底物,从而激活了RNA降解机制,导致外源基因转录后水平上的实验也证实小鼠的运动功能明显改善。亨廷顿舞蹈病是外显子沉默,脱腺苷化的mRNA作为异常RNA或RNA指导下的RNA1中HD基因引起多谷氨酰胺扩增,生成了毒性 huntingtin蛋白聚合酶模板,在细胞质中作为潜在的基于同源降解机制的激活(htt)。理论上,沉默 huntingtin基因能减轻神经毒性缓解舞蹈症剂,只要有足够的宿主编码RNA指导下RNA聚合酶的底物,反状。 Harper等将htt- shRNA质粒以AAV为载体转染小鼠,htt义RNA就能被合成。如果相关mRNA的3′端特定部分降解,就mRNA被抑制55%~85%,包涵体基本消失,对正常的内源性htt会引起转录后水平的基因沉默12没有影响。 Rotarod运动实验证明,转染 shRNA的小鼠的运动功3RNAi的应用能明显改善。肿瘤是一种多基因突变累积与相互作用形成的细3.1探索基因功能的有力工具胞异常增生。由于RNAi能沉默特定基因的作用,可能在诱导凋在功能基因组研究中,需要对特定基因进行功能丧失或降低亡、增加药物敏感性、抑制突变基因和血管生成等多方面成为突变,以确定其功能。由于RNAi可以使特异基因mRNA发生降新的肿瘤治疗方法。p53变异发生在50%的人类肿瘤,变异的p53解,从而获得特定蛋白功能丧失或降低的突变株。因此RNAi可会影响野生型p53的功能。因此,应用RNAi沉默变异的p53可以作为一种强有力的研究工具,用于研究功能基因组。而与其他以恢复野生型p53的功能。Bcl22是调控凋亡的基因家族,高表达几种进行功能丧失的技术相比,RNAi技术具有明显的优点,该技会引起肿瘤耐药。业已证明,沉默Bc22可促进肿瘤细胞凋亡,恢术高效、特异、低毒性、周期短、操作简单等优势是传统的基复对药物的敏感性。Bcr/Abl是最早发现的融合基因,它的表达敲除技术和反义技术所无法比拟的。RNAi技术在线虫全基因是引起慢性粒细胞白血病CML)的主要原因。Bcr/Abl- siRNA组功能硏究及果蝇、锥虫研究中均有很广泛的作用。线虫全基能明显抑制CML细胞中Bcr/ abImRNA表达,却不影响c-abl和因组已于1998年测序完毕,RNAi的发现又为系统和高通量研究c-bcr表达,Bcr/Abl2 esiRNA能使各种细胞株对y射线和STI571线虫全基因组功能提供了可能。许多小组应用高通量的RNAi技(imat中国煤化工M细胞调亡术完成了功能基因组的分析,通过RNAi使预知的19427个基因4CNMHG中约95%的基因表达下调,实验方法是:先用PCR方法或反转录Ax不明儿不L任亚研究领域引起了巨大反响,方法大规模获得基因库,直接体外或体内转录生成 dsRNA,再用由于能够快速而简便的制备某个基因的功能缺失表型,它已成为CHINA FOREIGN MEDICAL TREATMENT中外医疗13中外医疗MEDCAL THEATMENT基础医学基因功能研究中最有效的工具但在实际应用领域,一些问题仍待解3191~3197决,如:如何选择合适的载体;对于不同生物有效的sRNA的特征需要7] Zamore PD, et al. RNAi: double- stranded RNAdirects the AtP-de认;如何提高RNA的效率找到一种高效而低毒的适于人pendent cleavage of mRNAat 21 to 23 nucleotide intervals[J]体的转染系统;如何避免脱靶效应;如何应对新的突变。但无论如何cell,2000,101(1):25-33作为一种重要的研究基因功能的有效工具,随着RNA研究的不断完8] Elbashir S M, Lendeckel w, Tuschl T RNAinterference is mediated善和广泛应用,它将在生命科学的研究疾病的防御及治疗中发挥重by 212and 222nucleotide RNAs[].Genes Dev, 2001, 15(2):要的作用。参考文献[9] Bernstein E, Caudy AA, Hammond S M, et al. Role for bidentate[1 Marx, JInterfering with gene expression[J]. Science, 2000, 288: 1ribonuclease in the initiation step of RNAinterference J]. Nature,370~3712001,409(6818):363~368[2] Guo S, Kemphues KJ Par2l, a gene required for establishing [10] Robin A RNAi and heterochromatin-a Hushed-up affair[]. Science,polarityin C elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase2002,297:1818~1819that is asymmetrically distributed[J]. Cell, 1995, 81(4): 611-620[ll] Jones L, Ratcliff F, Baulcombe DC. RNA2directed transcriptionalgene silencing in plants can be inherited ineinterference by double st randed RNAin Caenorhabditis elegans[J]RNAtrigger and requires Metl for maintenance[]. Curr Biol, 2001Nature,1998,391:806-810ll(10):747~757[4] Hamilton AJ, Baulcombe DC.Aof small antisense RNAin[12]孙建国,座荣霞,陈正堂,RNA干涉分子机制研究进展[].生posttranscriptional gene silencing in plants[]. Science, 1999, 286物化学与生物物理进展,2002,29(5):678-68113] Fraser AG, Kamath RS, et al. Functional genomic analysis of C.[5] Hammond SM,et al. An RNA-directed nuclease mediates post-tran-elegans chromosome I by systematic RNAinterference[J]. Nature,scriptional gene silencing in Drosophila cells[J]. Nature, 2000, 4042000,408(6810):325-330(6775):293[6] Tuschl T, Zamore P D, Lehmann R, et al. Targeted mRNAdegrada【收稿日期】2008-12-13tion by doublestranded RNAinvitro[]. Genes Dev, 1999, 13(24)《科技创新导报》稿件要求及投稿说明稿件要求1、稿件应具有科学性、先进性和实用性,论点明确、论据可靠、数据准确、逻辑严谨、文字通顺。3、所变题家在半位内,计学号国家标学名词及符号4、参考文献按引用的先后顺序列于文末6、正确使用标点符号,表格设计要合理,推荐使用三线表。7、图片要请晰,注明图号。1、来稿律使用Word排版且具有一定的学术水平,以2700宇左右为宜,并保证文章版权的独立性,严禁抄袭,文责自负,请勿一稿多投,欢迎投稿2、本刊已加入《中国学术期刊(光盘版)》、《中文科技期刊数据库》、《数字化期刊群》等网络媒体,本刊发表的文章将在网络媒体上全文发布。3、本刊编辑部对来稿有修改权,不愿改动者请事先说明。自收稿之日起1个月内未收到刊用通知,作者可自行处理4、来稿请注明作者姓名、单位、通讯地址、邮编、联系电话及5、本刊发表周期为10天,出刊后5天内邮寄样刊中国煤化工6、如有一稿多投、剽窃或抄袭行为者,一切后果由作者本人负责CNMHG14中外医疗 CHINA FOREIGN MEDICAL TREATMENT