海藻酸锰固定化细胞的乙醇发酵

第27卷第4期南京林业大学学报(自然科学版Vo.27,No.42003 A Journal of Nanjing Forestry University( Natural Sciences Edition) Jul, 2003海藻酸锰固定化细胞的乙醇发酵宋向阳,徐勇,杨富国,勇强',余世袁(1.南京林业大学,江苏南京210037;2.中甯大学,湖南长汐410083)攏要:以树干毕亦酵母( Pichia stipitis为发酵茵株,利用海藻酸锰凝胶代替海藻酸钙,固定化酵母使用寿命明显増加。采用混合糖60g/L.(50%菊苟糖、50%木糖)为发酵底物,以250mL三角瓶为反应器,在35℃、150r/min、pH5.0条件下,派荡发酵。结果表明,海藻酸锰树干毕赤固定化增殖醐母细胞能使戊糖和己糖同步发酵,海藻酸锰凝胶耐磷酸盐能力是海藻酸钙凝胶的3倍,海藻酸锰圊定化树干毕赤酵母細胞乙醇发酵42d,固定化细胞稳定,总糖利用牽为95.8%,乙醇得率为狸论得率的.3%,发酵稳定时间明显长于海藻酸钙固定化酵母细胞乙醇发酵的稳定时间(24d),关键词:树干毕赤酵母;海藻酸锰;固定化细胞;戊糖;乙醇中图分类号:Q53文献标识码:A文章编号:1000-2006(2003)04--0001-04Fermentation of Ethanol by Immobilized Cells of Manganese AlginateSONG Xiang-yang, XU Yong, YANG Fu-guo',YONG Qiang, YU Shi-yuan(1. Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China; 2. Central SouthUniversity, Changsha 410083, ChinaAbstract: The life time of immobilized Pichia stipitis yeast cells was prolonged greatly when the gelwas forned with manganese alginate compared to that with calcium alginate. The ability of enduringphosphate of manganese alginate gel was inereased 3 times than that of calcium alginate gel. Fermentation of glucose-xylose mixture to ethanol was investigated in 250 mL shake-flask at 35C, pH 5.0 and150 r/min. Glucose-xylose mixture could be co-fermented to ethanol by immobilized Pichia stipitiyeast cells of nanganese alginate The results showed that immobilized cells of manganese alginate gewere still definite when fermentation of ethanol lasted 42 d, and utilization ratio of total sugar was95. 8%c, yield of ethanol rcached 92. 3% of theoretical, While fermentation of ethanol by immobilizedPichia stipitis yeast cells of aluminum alginate only lasted 24 d. It provided the basis of theory for producing ethanol with immobilized cells in industry.Key words: Pichia sti pitis Manganese alginate; Immobilized cells; Xylose; Ethanol固定化细胞技术根据固定化方法大致分为吸附法、包埋法、共价法和交联法,其中以包埋法应用最为普遍。载体是固定化细胞技术的核心部分。包埋法中的载体有多种,如聚丙烯酰胺凝胶、海藻酸钙、角叉菜聚糖、琼脂糖、明胶等。目前固定化细胞技术已成为国际上研究的热点之一2-,广泛应用于工业、医学、环境保护、能源开发及化学分析等诸多领域海藻酸钙是迄今应用最为广泛的一种固定化载体。它具有网格孔隙大、传质阻力小、制备方法简单及价格低廉等优点。但其强度较差,使用寿命短。这主要是由于培养基中的磷酸盐逐渐使海藻酸钙凝收筷日期:2002-04-25修回日期:2003-0103中国煤化工基金项目:国家自然科学基金资助项目(39970597)作者简介:宋向阳(1965—),男,江苏无锡人,南京林业大学化学工程学CNMHG南京林业大学学报(自然科学版)第27卷第4期胶破裂和解休。延长海藻酸钙凝胶使用寿命的处理方法较多。笔者利用Mn3对Ca2-置换法,将低浓度的树干毕赤酵母( Pichia sti pitis)细胞固定,通过增殖培养,能高效地同步发酵戊糖和已糖,形成的海藻酸锰圊定化酵母细胞耐磷酸盐能力显著増强,其使用寿命显著增加。为固定化细胞乙醇发酵的工业化生产提供理论依据。材料与方法1.1菌种和培养基菌种为树干毕赤酵坶( Pichia stipitis),由南京林业大学生物化工研究所保藏,该菌种能够同步发酵戊糖和己糖。酵母细胞培养基为木糖20.0g/L,蛋白胨5.0g/l.,酵母汁3.0g/L,培养基pH5.0;固定化增殖培养基为葡萄糖30.0g/L,木糖30.0g/L,蛋白胨3.0g/L,酵母汁2.5g/L,CaCl2.5g/L,MgS(25g/,KH2PO2.5g/I,培养基pH5.0;发酵培养基为葡萄糖30.0g/L,木糖30.0g/L,CaCl22.5g/L,MgSO30.25g/L,KH2PO42.5g/I,培养基pH51.2固定化细胞的制备与增殖将试管斜面菌种接入液体酵母细胞培养基,在30℃、150r/min条件下活化2d,取2mL菌液与3%海藻酸钠溶液(68mL)于常温下混合,注人2%CaCl2水溶液中,固化4bh,用无菌水将固化后的海藻酸钙凝胶球(直径2~3mm)洗3次(每次50mL),移入1.2%MnSO4溶液中,放置冰箱(4℃)固化24b。将固定化好的凝胶球〔直经约3mm)置于增殖培养基中,在30℃、150r/min条件下增殖培养12h更换一次新鲜培养液,共增殖4次L.3乙醇发酵将固定化凝胶球川无菌水洗3次后,移人发酵培养基中。发酵容器为250mL三角瓶,发酵液体积与凝胶球的堆积体积之比为3:2,其中发酵液体积为50m1,总体积为80mL。将三角瓶置于恒温振荡器中,在35℃、150r/min条件下进行乙醇发酵。利用固定化细胞重复式发酵,每一批发酵结束后,收集发酵液,接入新鲜发酵液。1.4分析测定当一批发酵结束后,倾去发酵液,称取三角瓶与固定化细胞质量,减去空三角瓶质量,即为固定化细胞凝胶颗粒湿重。利用髙效液相色谱法测定乙醇含量。釆用3,5-二硝基水杨酸(D丶`S)法测定还原糖2结果与分析2.1固定化凝胶颗粒耐磷酸盐能力海藻酸钙是∽种应用较为广泛的固定化载体,但其强度较差,使用寿命短。在制备海藻酸钙凝胶颗粒过程中添加活性炭、Al2O3、SO2、MnCl2等,尽管表1固定化细胞凝胶颗粒耐磷酸盐能力可不同程度地增加海藻酸钙的机械强度及稳定性, Table 1 Test of enduring phosphate of gel bends但由于发酵培养基中的磷酸盐逐渐使海藻酸钙凝胶on cells immobilization颗粒破裂和解体,所以海藻酸钙凝胶使用寿命提高实验添加物添加物质凝胶颗粒溶凝胶颗粒破量分数%解时间/min裂时间/min并不明显。试验通过Mn2对Ca2-置换法,形成的1A2O3(A)藻酸锰固定化酵母细胞耐磷酸盐能力明显增强。2A!O(B试验过程为:分别称取1g固定化凝胶颗粒,溶于MnCl4A)50m浓度为0.1mol/l的磷酸盐中性缓冲液中4 MoCk(B5 Sick(A240于35℃条件下,间歇振荡,确定固定化凝胶颗粒开65)(B)裂及溶解的时间,以测试凝胶颗粒耐磷酸盐能力,7活性炭(A结果见表18活性炭(B)9空H从表1可见,海藻酸钙凝胶颗粒中添加剂不同,10中国煤化工其耐磷酸盐能力也不同。添加活性炭的固定化凝胶颗粒耐磷酸盐能力没有明显提高,由于活性炭表面YHCNMHG如物在灭后加人203年总第106期末向阳等:海藻酸锰固定化细胞的乙醇发解积比较大且具有多孔性添加到海藻酸钙凝胶颗粒屮,增加了固定化细胞的通透性,但其耐磷酸盐能力提高不多,开裂时间为30min,比空白(不添加物的)多10min,溶解时间均为120min。添加SO2比Al2O)3效果要好,耐磷酸盐能力提高2倍,这是由于SO2为原子型晶体强度较高,添加至凝胶颗粒中可增加其强度。而采用詈换法形成海藻酸锰、海藻酸铝的固定化细胞耐磷酸盐能力增强显著,因为Mn3、A}把Cn-从海藻酸钙凝胶颗粒屮置换出来,磷酸盐对海藻酸锰、海藻酸铝的凝胶颗粒破坏性减少,故海藻酸锰、海藻酸铝的圊定化细胞耐磷酸盐能力提高3倍。2.2MnSO4溶液浓度对固定化细胞乙醇发酵的影响配置0.4,0.6%,0.8%,1.0%,1,2%,1.4%,1.6%的MnSO溶液,利用Mn2对Ca2+置换法,分别制备成海藻酸锰固定化酵母细胞。通过增殖培粟养,使凝胶株表面的树干毕赤酵母细胞密集,形成高浓度的固定化酵母细胞,高效地利用戊糖、己糖同步发酵成乙醇。MnSO4溶液浓度对固定化细胞乙醇0.40.60.81.01.21.41.6发酵糖利用率的影响见图1。hs04溶液质量分数%由图1可见,MnSO溶液浓度对固定化酵母细图1MsO溶液质量分数对固定化细胞乙醇胞乙醇发酵的影响较大。当MnSO4溶液质量分数为发酵糖利用率的影响0.4%~1.2%时,随着Mn2浓度的增加,还原糖利Fig.1 Effects of concentration of MpSO, solution用率逐渐升高。如MnSO4溶液质量分数为0.4%,lization ratio of sugar of ethanol fermentation0.6%,0.8%,1.0%时,还原糖利用率分别为by cells immobilization91.7%,92.8%,93.6%,94.6%,当MnSO4溶液质量分数为1.2%时,还原糖利用率达最大值95.8%。而当MnSO4溶液质量分数超过1.2%时,随着Mn2+浓度的增加,还原糖利用率反而下降。即MnSO4溶液质量分数1.2%为转折点。这是因为Mn2浓度对海藻酸钙的置换影响较大。当MnSO4溶液质量分数为0.4%,由于Mn2+浓度低,海藻酸根螯合及置换出海藻酸钙中的Ca2-形成的海藻酸锰凝胶的作用较弱凝胶株强度差,稳定性低。显微镜下观察,醪液中溢出的游离细胞较多,还原糖利用率为91.7%;当MnSO溶液质量分数超过1.2%时,虽然凝胶株的机械强度有所提高,醪液中游离细胞减少,但是凝胶株弹性变小,且凝胶株介质表面过于稠密降低了底物及营养盐通过酵母细胞的传质能力,故还原糖利用率下降。结果表明,当MnSO溶液质量分数为1.2%时,形成的海藻酸锰固定化酵母进行乙醇发酵最佳2.3发酵液pH对固定化细胞乙醇发酵的影响将海藻酸锰固定化增殖酵母凝胶颗粒各30mL表2发酵液pH对海藻酸锰固定化细胞分别放入体积为50m不同pH混合糖(混合糖浓乙醇发酵24h的影响度为60g/L,木糖和葡萄糖各占50%)的发酵液中, Table 2 Effects of pH value of the broth on ethanol在35℃、150r/min条件下,发酵24h,结果见表2。fermentation for lasting 24 h by cells从表2可见,发酵液pH在3.0~6.0范围内immobilization of manganese alginate发酵液残糖还原糖利固定化酵母乙酵得率比发酵液pH越低,越不利于海藻酸锰固定化酵母细pH浓度/g·1.用率%细胞湿重/R理论得率胞的生长和繁殖。当发酵液pH3.5时,残糖浓度3028.5452.442.3高达16.72g/L,乙醇得率为理论得率的32.1%。3.516.727218.5显微镜下观察酵母细胞,部分形态已不圆滑,单细胞03.9393.50.8960.918较多,芽孢少,即酵母细胞长时间在pH3.5以下发.52.5395,80.923生变形,其生物功能降低或丧失,糖代谢能力下降,6.0己醇得率显著降低。当发酵液pH为4.0时,酵母细胞形态圆滑,糖利用率高,残糖仅3.93g/L,乙醇得率为理论得率的896%。发酵液pH5.5时,乙醇得率为理论得率的92.3%。发酵液pH大于5.5时乙脾得率虽有提高,但工业生产时高pH发酵液易染菌。H中国煤化工*藻酸锰固定化细胞乙醇发酵较适宜,此结果与海藻酸钙固定化酵母乙醇发CNMHG南京林业大学学报(自然科学版)第27卷第4期2.4海藻酸钙、海藻酸铝及海藻酸锰的乙醇发酵利用海藻酸钙、海藻酸铝和海藻酸锰的固定化7增殖树干毕赤酵母细胞,在35℃、150r/min条件下对浓度为60g/1混合糖(50%葡萄糖、50%木糖)分别进行发酵试验(图2)。结果表明,3种固定化增殖墼4树干毕赤酵母细胞前24d乙醇发酵均较稳定,但蛋卷立24d以后差异明显发酵至36d,海藻酸钙固定化细胞乙醇发酵中,122428364248残糖浓度由2.87g/I(24d)上升至3.53g/L-,其固醇周期/d定化细胞重量由59.4g下降至53.6g、减少5.8g;图2海藻酸钙、海藻酸铝、海藻酸锰而海藻酸锰固定化细胞乙醇发酵稳定,固定化酵母固定化细胞的乙醇发牌细胞流失少,仅减少2.6g。即海藻酸钙、海藻酸铝和i.2F: thanol fermentation of inmumolilizcd cells of calcium海藻酸锰的固定化酵母细胞乙醇发酵可分别稳定发lginate, aluminum alginate and manganese alginate酵24、36及42d。这是因为发酵培养基中磷酸盐逐■海藥酸钙固定化细胞乙醇发酵残糖浓度:◇渐使海藻酸钙凝胶破裂,而海藻酸铝、海藻酸锰的圊酸锰定化细胞乙醇发酵残糖浓度:·海藻酸铝同定化细胞耐磷酸盐能力明显强于海藻酸钙固定化细化细胞乙牌发酵残糖浓度;“▲-海滦酸钙固定化胞凝胶颗粒重:-×一海藻酸铝固定化细胞胶颗莉重胞。海藻酸锰圊定化酵母细胞乙醇发酵稳定性长于-。—海落酸误因定化组胞凝胶颗粒重海藻酸铝的固定化酵母细胞,因为海藻酸锰凝胶颗粒强度虽然略差于海藻酸铝固定化细胞,但海藻酸锰凝胶颗粒富有弹性,细胞固定得牢固·凝胶颗粒不容易破碎。海藻酸铝固定化细胞凝胶颗粒强度较大但凝胶颗籼比海藻酸锰固定化细胞凝胶颗粒脆性大,容易产生裂痕,最终导致细胞流失及凝胶颗粒自溶。所以,海藻酸锰固定化细胞乙醇发酵要比海濚酸铝固定化细胞乙醇发酵稳定时间长6d3结论(1)Mn3-对Ca置换形成的海藻酸锰固定化酵母细胞耐磷酸盐能力明显增強,而MnS(.溶液浓度对固定化酵母细胞乙醇发酵糖利用率的影响较大。以不同质量分数MnSO4溶液分别制成的海藻酸锰固定化细胞进行乙醇发酵,当MnSO.溶液质量分数为1.2%时,海藻酸锰圊定化酵母乙醇发酵的糖利用率最高,达95.8%(2)耐磷酸盐能力试验表明海藻酸钠溶液中添加SiO效果较好,形成的海藻酸钙固定化细胞耐磷酸盐能力是不添加的2倍。而以置换法形成的定化酵母细胞要比以添加法形成的好,形成的海藻酸锰固定化酵母细胞耐磷酸盐能力是不添加SiO2的3倍。〔3)采用置换法形成海藻酸锰固定化细胞,其发酵稳定性由24d延长至42d,乙醇得率为理论得率的92.3%。[1张树政酶制剂工业:上[M].北京:科学技术出版社,998:350.[2j Lata A, Garria L. A Dhazm. Analysis and description of the evolution of alginate immobilized cells systems[J] Journal of liotechnola-8y2000,80:203-2153JMassirmilano F Federico F.Laura S, et al. Repeated-batch production of pigments by immobilized Monascus Purpureus.J.Journal ofiotechnology.2000,80:271-276.1 J Mahesh S K, Maria B, Christopher K S,et al. Ethanol production from glucose and xylose by immobilized Z ynzomonas nzohitis CPI[_. Applied Biotcchmistry and Biotechnology, 2000.84-86,525-5415]严复,曲立民,金夙燮,等.高联海藻酸钙固定化酵母的制备及其化学稳定件的研究[].牛物工科学报,1985,11):81-816]田小光,海藻酸铝固定化酽母生产高浓度酒精的研究[].微生物学通YH中国煤化工CNMHG李燕文)