RNA干扰技术

第35卷第2期温州医学院学报Vol.35 No.22005 年4月Journal of Wenzhou Medical CollegeApr.2005综述疆RNA干扰技术俞富军，陈永平(温州医学院第一附属医院感染内科，浙江温州325000)[关键词] RNA干扰; 基因沉默;双链RNA[中图分类号]R 459.5[文献标识码] B [文章编号] 1000-2138 (2005) 02- 0168-03在基因治疗领城里，继反义RNA、核酶和三链DNA基本作用模式最近得到实验证明。技术之后，现在又掀起了RNA干扰技术，这项技术在第一种模式: Dicer和Sicer依赖模型。这种是2002年度里荣登美国著名“科学”杂志评选出的世界十人们用果蝇胚胎细胞及培养细胞s2作为研究对象发现大科技进展之榜首，现将有关RNA干扰技术作一一介绍。的，它主要包括四个步骤:①长的双链RNA在导入细胞后首先被剪切为长度21 ~25个核苷酸的双链RNA分子，1 RNA 干扰的定义和发展即小干扰RNA，在这一步骤中，Dicer 参与对双链RNA .RNA干扰是指一种双链RNA分子在mRNA水平上关的剪切作用。②小干扰RNA与一种蛋白复合物相结合，闭相应序列基因的表达使其沉默的过程,是- -种序列特这种蛋白复合物含有一个小干扰RNA分子和一个蛋白核异性的转录后基因沉默机制。1995年康奈尔大学郭博酸酶分子。目前这种酶分子已被分离出来，有人将它命士在试图阻断秀丽新小杆线虫par21基因表达时意外发名为Sl1icer.③在小干扰RNA的指导下，蛋白复合物现了RNA干扰现象川。给对照实验组线虫注射正义RNA,产形成了一种有活性的RNA诱导的基因沉默复合物。④在生与反义RNA同样的结果一特异性阻断 该基因的表达，少量或没有ATP参与的情况下,基因沉默复合物识别与这一与反义RNA技术传统认知相矛盾的现象直到1998小干扰RNA具有同源互补序列的靶mRNA，并对靶mRNA年才有了新的解释。卡耐基研究院Fire等发现，正义进行剪切而产生RNA干扰作用。RNA和过去反义RNA对基因表达的阻断都是由体外转录第二种模式:随机降解PCR模式。这种模式的作用制备RNA中污染的微量双链RNA所引起[2。将制备的RNA机制与一种名叫RNA依赖性RNA聚合酶有关。RNA依赖高度纯化后发现，正义RNA无基因抑止作用，反义RNA性RNA聚合酶不仅可以扩增双链RNA，同时也可以扩增的基因抑止作用也很弱;而用纯化后的双链RNA注射线小干扰RNA。随机降解PCR模式的作用机制是: RNA依赖虫，却能高效、特异地阻断相应基因地表达。此后，又性RNA聚合酶利用小干扰RNA链作为引物，以靶mRNA作在果蝇、锥虫、涡虫、无脊椎动物、脊椎动物、植物和为模板来合成新的双链RNA。合成的双链RNA分子被哺乳动物细胞中发现了RNA干扰现象。Dicer水解。被Dicer水解释放出的新的小干扰RNA又可以作为引物指导新- ~轮的双链 RNA的合成和降解。人2 RNA 干扰的作用机制们在果蝇、真菌、线虫等细胞内均检测到这种RNA依赖近年来研究发现，小干扰RNA是RNA干扰作用赖以性RNA聚合酶的活性，但在人类细胞中还未见有类似报发生的重要中间效应分子。小干扰RNA具有特征性结构，道41。即长约21~25个核苷酸的特殊双链RNA分子;小干扰3 RNA干扰的特点RNA的序列与所作用的靶序列具有同源性;小干扰RNA两条单链末端为5，端磷酸和3，端羟基;每条单链的跟传统的基因治疗技术相比, RNA干扰在基因功能3，端均有2~3个突出的非配对的碱基@。和相关“ 中国煤化工优势。RNA干扰确切的作用机制目前还不是很清楚，两种.8.1粗MH的反义链和正义链对介导CcNM H G连所起的作用尚不清楚。收稿日期: 2004-03-30作者简介:俞富军(1975-),男，浙江绍兴人，住院医师，硕士生。3.2特异性RNA 干扰最显著的特征就是只引起与双-168一第35卷俞富军，等: RNA干扰技术第2期.链RNA同源的mRNA降解，而对其他无关基因的表达不小功能研究。其中双链RNA合成成本很高，双链RNA转影响。入宿主细胞效率以及其在宿主细胞中的稳定性及RNA干3.3 高效性无论是在体内还是体外实验中，仅需少扰作用效率均不确定。②体外转录法。这种方法采用量的双链RNA就能有效地抑止靶基因表达，抑止效率在I7RNA聚合酶，以先合成的DNA链为模板分别转录合成低等动物中大于90%，这表明双链RNA介导的RNA干扰正义和反义RNA，将正义和反义RNA混合，再经退火复是一个以催化放大的方式进行的●性得到双链RNA,从而使台成双链RNA的成本大大降低，3.4 双链RNA长度限制性 引发有效RNA干扰的双链但这种方法与化学合成方法有相同的缺点.③体内载体RNA最短不得短于21个碱基，而且长的双链RNA也在细合成法。这是由P atrick等首先报道的利用载体在细胞内被Dicer酶切割为21个碱基左右的小干扰RNA，并胞体内稳定地表达siRNA从而抑制哺乳动物细胞靶基因由小干扰RNA来介导mRNA切割。表达的方法0.11。其基本思路如下:细胞内存在RNA聚3.5 可传播性RNA干扰有一种令人惊奇的跨越细胞合酶II，它可以识别U6启动子，从而使启动子后的基界限的能力，在果蝇细胞中可在细胞群落之间传播。在因转录成RNA，当模板连续出现3~5个T碱基时，转录线虫中可在局部注射双链RNA而传播到整个机体问。就会终止。根据这一机制，可以设计一种能表达RNA的3.6 ATP依赖性 在去除ATP的样品中，RNA千扰现象质粒，其组成包括四个部分: a.常用质粒的基本序列。降低或消失，表明RNA干扰是一个ATP依赖的过程。b、U6启动子，位于克隆位点的上游。C、克隆位点。d3.7转录后水平的 基因沉默机制注射 该基因的内含RNA千扰模板序列。这部分序列具有如下特点:含RNA子或者启动子顺序的双链RNA都没有千涉效应，翻译抑干扰序列，对哺乳动物而言通常为21~23个核苷酸;制剂对RNA干扰也不产生影响。发卡结构环状部分，通常有4~7个核苷酸;靶序列的反向互补序列: 3~5个核苷酸T.将具有如上结构的质4 RNA 的实验技术及其进展粒导入细胞内，体内的RNA聚合酶I就可以合成- - 条4.1小干扰 RNA序列设计方法在基因库中 寻找靶向RNA链，这条RNA链可以通过两端的21个左右的核苷酸基因mRXA序列，并从基因编码序列的起始密码子开始反向互补特性而形成发卡样双链结构，从而起到基因抑向下游寻找腺苷二核苷酸，标记并选择每个腺苷二核苷制作用。这种技术操作简便，使用成本低，与直接导入酸及其下游邻近的19个核苷酸序列--起作为mRNA的靶小干扰RNA相比，DNA质粒更易导入细胞内，而且质粒序列。在设计小干扰RNA的过程中，要避开mRNA的5'导入细胞后存在时间长且稳定，对靶基因的表达抑制效和3’非编码区以及5'起始密码区附近50~100个核苷率高，便于进行较长时间的基因功能研究，因而近日来酸的序列，因为在这些区域含有丰富的蛋白结合位点，成为一种热门技术。结合的调节蛋白以及形成的翻译起始复合物等可以影响4.3 RNA干扰技术存在的问题 目 前RNA干扰机制尚RNA诱导沉默复合物结合到靶mRNA上间。为了选择合适未完全阐明，尤其在哺乳动物细胞中的报道不多，小千的小干扰RNA靶序列,必须将上述包括腺苷二核苷酸在扰RNA在哺乳动物细胞中抑制mRNA表达是有效的，但内的21个核苷酸的序列，根据实验对象的不同,选择不并不能像在果蝇细胞中那样完全抑制目的基因的表达，同基因组数据库进行全基因组描和序列同源分析，确可能是因为生物体是一个复杂的系统,存在多种机制相保选择的小干扰RNA序列与基因组中其他基因至少存在互作用以调控基因的表达。另外在哺乳动物中RNA干扰3个以上的碱基不同，同时在进行小干扰RNA或双链RNA能否成功地抑制基因表达以及其抑制的程度还取决于细序列设计时要尽量沿靶基因序列多设计几个不同序列，胞类型。对线虫来说可以采用注射、浸泡或喂食的方法通过转染细胞选出效果最好的序列，因为对于mRNA的转入双链RNA，而对哺乳动物来说，寻找高效的方式来.不同区域序列同源的小干扰RNA产生的RNA干扰的效率转入小干扰RXA以及快速的方式来筛选RNA干扰尚需进是不同的。最后根据已经设计的21个反义RNA序列合成-步 探索。RSA干扰在病毒感染中的应用令人振奋，但2条RNA链，在其二链的3’末端最后2个核苷酸设计合中国煤化工A发生作用，有些病毒成dTdT序列，以减少细胞内降解。靶YHCNMHG&者位于高度折叠的区4.2 小干扰RNA合成方法 ①体外化学合成方法。最域中，而有些病毒序列可能与蛋白质形成紧密的复合为经典的方法，共分四个步骤: a、化学合成双链RNA。物，阻碍了与小千扰RNA的识别。因此不仅要选择合适b、将双链RNA导入宿主细胞.c、检测靶基因抑制效率。的靶序列，而且需要反复试验。为了克服这个障碍，所-169一第35卷温州医学院学报第2期选病毒RNA的靶序列必须是高度保守的，或者设计几对有专家认为RNA干扰现象的研究，可能是未来十年小干扰RNA同时作用于病毒。再者还需要注意有些病毒生物学领域中最激动人心，也最有可能产生丰富成果的会产生较多的代谢产物，也可以影响小千扰RNA抗病毒领域之-。尽管目前RNA干扰技术在哺乳动物中的应用的效果。还处于探索阶段,但它在斑马鱼和老鼠胚胎等脊椎动物中的成功应用，预示RNA干扰将成为疾病尤其是肿瘤基5 RNA干扰研究的应用 前景因治疗中重要的组成部分，人工合成的双链RNA寡聚药5.1 研究基因功能的新工具在对基因组进行功能分析物的开发将可能成为极具发展前途的新兴产业。时，需要对特定基因进行功能丧失或降低突变，以确定参考文献: .其功能。由于RNAi具有高度的序列专- -性，可沉默特异基因，因此被视为功能基因组研究的有力工具。Kamath[11 Guo S,Kemphues KJ.Par-I ,a gene required for establishingpolarity in C.elegans embryos,encodes a putative SerThr等用RNAi抑制蠕虫基因组中19427个基因中的86%，鉴kinase that is asymmetrically distributed [J]. Cell, 1995, 81定了1722个基因的突变亚型，其中有2/3的表型以往(4):611-620.未曾被注意门。同法抑制16757个编码蛋白质的预言基[21 Fire A,Xu S,Montgomery MK,et al. Potent and specific genetic因，其中许多基因与人类同源，如50%以上的蠕虫脂肪interference by double- stranded RNA in Caenorhabditis elegans调节基因在哺乳动物中有同源基因，对其进行研究将有[].Nature,1998,3916669): 806 -811.助于发现人类肥胖相关基因固,进而治疗肥胖或其相关[3] Zamore PD,Tuschl T,Sharp PA,et al.RNAi:double-strandedRNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at21 to疾病。与传统的基因敲除技术相比，这一技术具有投入23 nucleotide intervals []. l.l,00010(1):25- 33.少、周期短、操作简单等优势，近来RNA干扰成功地用[4Pal- Bhadra M,Bhadra U,Birchler JA,et al.RNAi related mec-于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志着RNA干hanisms affect both transcriptional and posttranscriptional扰将成为研究基因功能不可缺少的工具。transgene silencing in Drosophila [J.Mol Cell,2002, 9(2) :315- 327.5.2 研究信号传导通路的新途径 联合利用传统的缺失突变技术和RNA干扰技术可以很容易地确定复杂的信[5Caplen NJ,Fleenor J.,Fire A.et al.DsRNA-mediated gene si-lencing in cultured Drosophila cells: a tsse culture model号传导途径中不同基因的上下游关系。Clemensy 等应for the analysis of RNA itrerenecelJ.ene.2000252(1-用RNA干扰研究了果蝇细胞系中胰岛素信息传导途径，2):95- 105.取得了与已知胰岛素信息传导通路完全一致的结果，在[61McManus MT, Sharp PA. Gene silencing in mammals by small此基础上分析了DSH3PX1与DACK之间地关系，证实了interfering RNAs[J].Nat Rev Genet,2002,3(10):737-747.DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶9。RNA干扰技[7Kamath RS,Fraser AG,Dong Y,et al.System atic functiongalanalysis of the caenorhabditis elegans genome us ing RNAi术较传统的转染实验简单、快速，重复性好，克服了转[]. Nature,2003, 42(6920):231-237.染实验中重组蛋白特异性聚集和转染效率不高的缺点，[8] Ashrafi K,Chang FY,Watts JL,et al.Genome wide RNAi ana-因此认为RNA干扰技术将可能成为研究细胞信号传导通lysis of caenorhabditis elegans genome using RNAilI].路的新途径。Nature,2003, 421(6920):268-272.5.3 开展基因治疗的新策略RNA干扰具有抵抗病毒入[9] Moris JC.Wang Z.Drew ME,et al.Glycolysis modulates try-panosome glycoprotein expression as revealed by an RNAi侵、抑制转座子活动、防止自私基因序列过量增殖等作library[].EMBO J,2002.21(17):4429- 4438.用，因此可以利用RNA千扰现象抗击人类致病病毒。丙{101 Randall G,Grakoui A,Rice CM.Clearance of replicating型肝炎病毒是慢性肝病和肝细胞癌的主要致病因子,hepatitis C virus replic on RNAs in cell culture by smallRandall等以NSSB为靶位点合成siRNA转染Huh7细胞，interfering RNAs [J].Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(1):235- 240.发现HCV RNA表达下降80倍101。Kapadia 等以非结构Kapadia SB,Brideau Andersen A,.Chisari FV. Interference区为靶位点合成7个siRNA表达质粒转染Huh7细胞，发of hepatits C virus RNA replication by short interfering现NS3和NS5B的mRNA水平下降21倍和23倍，有效地中国煤化工,1004):2014-2018.抑制了病毒复制川。本文编辑:胡苗苗)“YHCNMHG-170-