常规PCR技术与单分子PCR技术

医学信息2010年11月第23卷第11期Medical Information.Nov 2010. Vol. 23. No.11临床医学粪便软化排出,或用肥皂水灌肠或肛门]内使用开塞露促使排便。心表1本组患者死亡率及护理满意度评价统计动过缓病人避免排便时过度屏气，以免兴奋迷走神经加重心动过疾病诊断患者人数死亡人数死亡率 护理满意度缓。生活不能自理的老年患者的饮食、大小便、洗漱等均由护士协助急性心肌梗死8非常满意完成。嘱患者戒姻限酒,减少心血管病事件发生的诱因。并且要注意冠心病50口腔黏膜及皮肤的变化,及时进行预防、护理。皮肤护理方面,应保心绞痛_5持床铺干沽,平整、无皱折,受压处给予勤翻身、局部按摩等。对于手术病人还应注意禁食时间。4讨论2.4病情观察护理心血管疾病常由某些因索诱发而加重,因此应加由于护理对象是老年心血管疾病的患者，心血管疾病属于危险强对患者的观察护理。首先应严密关注患者的体温、心率.血压.血病症,死亡率较高,这就要求护士要具备思维敏捷知识丰富、语言恰糖等生命体征变化,根据患者的全身情况制订基础护理的方案。同当及技术娴熟等良好的素质和高尚的职业道德。从患者的角度出发,时，及时了解患者不适主诉,如胸闷、胸痛、气短.并观察其部位,性让其感受到家- -样温 馨的住院环境.医护人员的细心体贴,做好每一质及持续时间，及时通知医生并采取措施。其次.要认真观察病情变位患:者的心理护理、生活护理和疾病的观察护理。只有通过精心、耐化,掌握专科常用药的作用、注意事项。心血管疾病药物对老年患者心的护理,才能为患者减轻病痛,提高治愈率,同时可以缩短住院日,与中年患者在剂量上有很多不同，因此,应根据老年人的排泄能力减少并发症,促进患者早日康复。差,肾功能减退的特点,严格学握剂量密切观察其精神状态、血压、参考文献:尿量及胃肠道反应,做好三查七对,加强巡视,输液时控制滴速,提[周丽霞等，对老年人心血管疾病的护理体会田中外健康文摘,2009,8.高静脉穿刺成功率,保护好患者血管。(27):185-186.3结果[2]沈宏云,心血管疾病的个性化护理D.医学信息,2010,23(2):206-207.本组198例患者，经过治疗护理后,除2例由于抢救无效死亡[3]王茵,心血管疾病患者的心理特点、生活质量及护理对策[J.中国实用护理外,其余患者的病情均恢复稳定出院.护理治疗的有效率为98.98%。杂志，2009, 25(9):85-86.编辑/雅兰本组患者死亡率及护理满意度评价统计如表1:常规PCR技术与单分子PCR技术刘连生(长江大学医学院，湖北荆州434023)摘要:常规PCR技术大都以大量DNA分子(一般为10个以上)为模板进行DNA扩增。单分子PCR技术是以极少量DNA分子(1、5或10个分子)为模板进行DNA扩增。在高保真度DNA聚合酶作用下,单分子PCR技术能扩增出高度一致的DNA;在低保真度DNA聚合酶作用下。单分子技术又能构建出大量突变基因的DNA文库。关键词:常规PCR;单分子PCR;DNA聚合酶PCR (polymerase chain reaction )的中文全称为聚合链反应。SM-PCR是基于常规PCR技术发展而来的,包括变性、退火、延PCR技术随着自身的发展及其与已有分子生物学技术的结合衍生伸3个基本环节,但在模板数量、引物设计.DNA聚合酶选择以及反了多种技术,如逆转录PCR( reverse tasription PCR, PT-PCR ).原应条件上与常规PCR存在较大区别。为PCR(in situ PCR )实时PCR(in situ PCR )等川。单分子PCR模板的准备:SM--PCR是在DNA模板稀释到极端条件下进行(single moleular PCR, SM-PCR )技术是最近发展出的新的PCR的扩 增反应.模板的质量直接决定实验的成败与扩增效率。实验中,技术。该文将着重介绍常规PCR技术与单分子PCR技术要点、特点首先用限制性内切酶消化质粒DNA得到含有靶DNA的片段，经常及其优点。规PCR扩增,PCR产物再经酚/氯仿抽提,酒精沉淀和HPLC等方式1常规PCR技术要点叫纯化。纯化的DNA用含0.1%(V/W)的蓝色葡聚糖2000或1ng/LPCR反应体系的基本成分包括:模板DNA、特异性引物、耐热tRNA的TE溶液“稀释到1个(或5个,或10个)分子/μl的终浓度。DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)、dNTP以及含Mg*的缓冲液。蓝色葡聚糖2000或Ing/LtRNA的作用是为了防止DNA吸附于管模板DNA的变性模板DNA经加热至94c,使模板DNA双链壁上,以保证模板DNA的正常变性.引物的退火以及链的延伸。完全变性或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链.同时引物的设计: SM-PCR 反应混合物中模板数极低，若引物之间引物自身以及引物之间的局部双链也得以打开。存在少量配对序列,循环扩增下极易形成二聚体。因此。在进行引物模板DNA与引物的退火模板DNA经加热变性成单链后,温设计时应严格控制其GC含量和Tm值,同时尽量避免引物间存在可度降至559C,引|物与模板DNA单链的互补序列配对结合。配对序列。实验证明，引物工作浓度在3μmo/L时,可以得到理想的引物的延伸将温度升至729C,DNA模板一引物结合物在PCR产物;高于或低于3μmo/L, PCR产物的数量都不理想!。TaqDNA聚合酶的作用下发挥酶活性，以dNTP为底物催化DNA的DNA聚合酶的选择SM- -PCR反应中模板数很少，循环数多，合成反应。上述三个步骤构成- - 个循环,新合成的DNA分子继续作dNTP损耗很为下一轮合成的模板,经多次循环(25-30次)后即可达到扩增DNA大,因此选择何种:中国煤化工需要产生突变。片段的目的。在体外定向进化中YHCN M HG变基因文库,因2 SM- -PCR技术要点此,选择低保真度TrspunA果口孵,共用大多八平小10/bp,扩增效率为70%时,将200bp长的片段扩增- -百万倍,产物错误率达33%收稿日期:2010-09-21临床医学医学信息2010年11月第23卷第11期Medical Information.Nov. 2010. Vol. 23. No.11间。在基因组测序及法医鉴定中，为获得大量无突变,高度- -致的下连续反应，显著提高了PCR反应产物的特异性。PCR扩增的特异PCR产物.通常选用高保真度pfuDNA聚合酶，其错误参入率为7x性还依赖于两个引物设计的好坏，依赖于引物与模板结合的准确性。10-7hbp, 在同样实验效率下将500bp 长的片段扩增- -百万倍,产物3.3操作简便、快速整个PCR操作过程,从标本处理、PCR扩增到错误率为0.7%m。产物分析。可在4h内完成全部实验。扩增产物可直接供作序列分析反应条件SM-PCR 的变性温度(96- 98C)大多比常规PCR和分子克隆,摆脱繁琐的基因分析方法,可直接从总RNA或DNA中(94C)高,其变性时间(5~ 15s )短于常规PCR(40),同时退火时间及或部分DNA已降解的样品中分离目的基因,省去须先进行克隆后再延伸时间也相应缩短;常规PCR循环为3~5h,因此必须选择热稳定作序列分析的模式。性好的DNA聚合酶。4 SM-PCR技术优点0预防污染SM-PCR 中模板数量极少,少量污染都会导致实验SM-PCR指的是以少量或单个DNA分子为模板进行的PCR。产生错误,甚至整个实验失败。在处理样品的过程中,微量移液器，4.1极少的模板数,通常为1.5或者10个DNA分子。空气等极易造成样品间的交叉污染。此外.试剂配制中也极易被污4.2更微型化的体系,SM-PCR体系大多在10ul 左右。染而导致SM-PCR污染。因此,实验中应注意设阴性对照。4.3可构建出大小可控的文库，不同模板数构建的文库大小是不同3 PCR技术特点叫的，如DNA模板数位10个分子时,文库大小是模板数为1个分子的3.1敏感性高PCR产物的生成以指数方式增加，能将极微量的靶10倍DNA成百万倍以上地扩增到足够检测分析量的DNA。这是PCR技参考文献:术最主要的特点,它可对单拷贝基因、单个细胞、单根头发、- -滴血[1]查锡良.生物化学[M]第7版.北京:人民卫生出版社, 209:4838 485.等微量标本进行分析。[2] 张杰道生物化学实验技术PCR技术及应用[M].科学出版社,2005:12-18.3.2特异性强自从提取出耐热TaqDNA聚合酶以来，在热变性处理[3] Yamane T, et al .Nippon Nofeik Kaishi , 2004,78(8):751-753.时不被消化,不必在每次循环扩增中再加人新酶，以及在较高温度[4]王国华,等生物化学与生物物理进展, 20.31(2);1592- 161.编辑/杜苏利鼓室冲洗注药治疗分泌性中耳炎疗效分析刘仁辉(四川省广元市剑阁县人民医院耳鼻喉科,四川广元628300)摘要:目的探讨分析鼓室冲洗注药治疗分泌性中耳炎(SOM)的临床疗效。方法将临床诊断为分泌性中耳炎的 223例患者随机分为鼓室冲洗注药组及常规治疗组进行临床对照研究。结果鼓室冲洗注药组和常规治疗组两组总有效率分别为91.3%和65.2%,鼓室冲洗注药组的总有效率明显高于常规治疗组(P<0.01)。鼓室冲洗注药组除耳内短时间闷胀外,均未出现剧烈疼痛、鼓膜损伤、大出血和咽鼓管损伤等术中并发症。常规治疗组3例出现粘连性中耳炎,鼓室硬化。术后随访,两组均未发现有咽鼓管狭窄等术后并发症。结论鼓室冲洗注药法治疗分泌性中耳炎可明显提高疗效,具有操作简单,疗效可靠,更易于病人接受。关键词:鼓室冲洗注药法;分泌性中耳炎;常规鼓膜穿刺;疗效分析本文对我院自2006年08月~2009年10月223例慢性分泌性出棉片,以6号细长针头于鼓膜紧张部前下方或后下方刺人中耳腔，中耳炎患者进行鼓室冲洗注药治疗,取得了理想的疗效,现报告如轻轻回抽至吸出气泡液体。鼓室注药治疗组:同上消毒麻醉,抽取地塞米松Iml ,a-糜蛋白1资料与方法酶5mg,6号细长针头行鼓膜穿刺,将药液缓慢注人鼓室,注药后嘱患1.1 - -般资料慢性分泌性中耳炎患者 223例，其中单侧中耳炎患者头偏向另一侧,按压耳屏3~5次，患者可感到咽腔发苦或有药液者188例,双侧中耳炎患者35例,共计258耳。男172例(单侧157流出,此后回抽鼓室内冲洗液,患者即刻可感到耳闷、胀感明显减例,双侧15例),女51例(单侧31例,双侧20例),年龄10-69岁,平轻。治疗完毕,清除外耳多余药液。1 次/周,2-4次为1疗程。疗程完均33岁。病程4d-11ao成后1周复查。两组治疗期间予以抗炎.抗组胺、稀化粘素.1%麻黄随机将其分为两组,鼓室冲洗注药组和常规治疗组,其中鼓室冲素滴鼻、抗生素.激素及配合鼓膜按摩,捏鼻鼓气等治疗。均嘱患者洗注药组109例(单侧92例,双侧17例,共计126耳),男82例,女复诊,1周未痊愈者再次同法治疗,治疗结束后复查纯音测听和声导27例,年龄11-68岁,平均年龄32岁;常规治疗组114例(单侧96抗,疗效判定标准参考文献标准。例,双侧18例.共计132耳),男90例,女24例,年龄10-69岁,平1.3统计学处理采用SPSS13.0软件做统计学分析.率的比较采用卡均年龄33岁。均有不同程度的上呼吸道感染史,鼻塞,耳鸣听力下方检验，P<0.05 ,表明两组间比较差异有统计学意义。降,耳内胀满感,伴(或不伴)耳鸣。两组病例在年龄、性别、病症上差2结果别无显著性(P>0.05)。2.1两组患者治疗疗效的比较两组总有效率 分别为91.3%和1.2方法常规治疗组:采取常规鼓膜穿刺治疗。患者取坐位,75%酒65.2%，经统计学x检验，具有统计学差异，且有显著性意义(P<精消毒外耳道皮肤,2%丁卡因棉片贴敷鼓膜表面麻醉,10min后取0.01),具体见表1。表1两组患者治疗疗效的比较组别耳数治愈(%)显效(%)有效中国煤化工总有效率(%)常规治疗组13260(45.5)10(7.6)16(12MYHCNMHG126(6.2)鼓室冲洗注药组26102(81.0) _10(7.9)3(2.4)_ 11(8.7).115(91.3)收稿日期:2010- 09-214380 !