RNA干涉技术

第22卷第3期平原大学学报2005年6月Vol.22 No. 3JOURNAL OF PINGYUAN UNIVERSITYJune.2005RNA干涉技术邓小莉(平原大学应用生物系，河南新乡453003 )摘要:RNAi是双链RNA介导的、序列特异性的转录后基因沉默，自1998年发现至今已有很大进展。本文综述了RNA干涉的分子机理及其应用研究进展。关键词: RNAi ;共抑制;功能基因组; dsRNA ; siRNA ;基因沉默中图分类号:Q781文献标识码:A文章编号:1008一3944(2005)03- 0104- 06收稿日期:2005-02 - 28作者简介:邓小莉(1962-),女,副教授,主要从事遗传学和作物育种学的研究。RNA干涉(RNA interference ,RNAi) 是指双RNA和双链RNA分别导入虫体后，作为对照的链RNA(double一strand RNA , dsRNA)在细胞有义核酸，虽不能与活性基因或mRNA结合，却内特异性地诱导与之同源互补的mRNA的降解，同反义核酸有相似的阻抑效应，与反义RNA技术使相应基因的表达关闭,从而引发基因转录后水平的传统机制相违背;而令人惊奇的是,双链RNA被沉默的现象。摄入机体细胞后，可特异性阻抑相应同源基因的表1 RNAi的发现与发展达，而且其效应较单链RNA至少高2个数量级，1990年,RichJorgensen等人对矮牵牛(petu-这种现象被称为RNAi[4。 由此就揭开了研究nias)进行了研究,尝试加深花朵的颜色。他们将一RNAi的序幕。个能产生色素(chalconesynthase)的基因前加上一人们在进-步的研究中，相继在植物5-6]、真个强的启动子后,转入矮牵牛中，结果没有看到期待菌57]线虫4、锥虫[8]、涡虫9]、果蝇[0]、水螅[1、小的深紫色花朵,多数花朵成了花斑甚至白色。因为鼠[12]和哺乳动物细胞[*](如人胚肾细胞Hela,细胞导入的基因和其内源基因同时都被抑制.所以Jor-等)中都发现有这一现象。这说明RNAi可能是生gensen将这种现象命名为协同抑制“co-suppres-物体中存在的一种普遍现象，代表了一个古老的细sion”[1]。开始认为这种现象是矮牵牛特有的,后来胞反应通路。近几年随着研究的深入,已经从多种发现在其他许多植物,甚至真菌中也有类似情况。生物中分离到参与RNAi的一些关键基因,对于1994年,Cojin把合成类胡萝卜素的基因(albi-RNAi产生的基本机制有了比较深入的了解，同时no-1或albino-3)转入野生型粗脉孢霉(Neurospo-发现RNAi与最初在植物中发现的共抑制(co-sup-racrassa),发现大约30%转染细胞内源性al-1或pression),以及真菌中存在的基因压制(qelling)al-3基因的表达水平反而大大减弱,当时称这种现.现象具有相似的基本机制,因而现在也习惯于将其象为压制“quelling"[2]。统称为RNAi。最近发现dsRNA除了可以诱发1995年.美国康耐尔大学的研究人员Guo和RNAi之外,在生命活动中还有其他重要的生理功Kemphues等在研究秀丽隐杆线虫par-l基因时能。因此,RNAi现象的发现,已被认为是近几年生(par-1的失活会破坏线虫的第--次卵裂的不对称命科学研究中的重要成果。性)，发现反义RNA和有义RNA也有类似的阻抑中国煤化工子机制效应，而两者的作用竟是相互独立的并且机制也不2.1MHCNMHG-样[3。为了进一步了解内外RNA结构及其引起尽管在不同的有机体内有些细节上是不同的，.效应差异的本质，1998年Fire等在研究秀丽隐杆但RNAi的作用机制是高度保守的。其基本原理是线虫基因沉默机制时结果发现，将反义RNA、有义将dsRNA裂解为21~25个核苷酸组成的小的干●104涉RNA ( SiRNA)以其作为介导子,引起相同序为磷酸基,3'端为羟基,且有2个突出的单核苷酸的列特异性的mRNA的降解13]。21~23个核苷酸(由于Dicer差异,片段大小略有差2.2促使dsRNA裂解的酶别)的小片段。这些小片段RNA称为小干涉RNA .促使dsRNA裂解的酶主要来自细胞中的核糖(small interfering RNA, siRNA)14。研究表明，核酸酶II家族(RNase II)。RNase III是目前已Dicer定位于胞浆，说明RNAi发生于自核内移出后知的唯-能在特定位点降解dsRNA成固定长度片的成熟mRNA[15]。现认为21~23个核苷酸大小在段的核酸酶。RNase II按照结构域的不同分为三3'末端带有2~3个碱基(dTdT或UU)悬端的类:第一类为细菌的RNaseII,包括单一结构域和siRNA诱导的RNAi效应最强[16]。因为21~23个dsRNA结合结构域;第二类是以果蝇为代表的核苷酸的RNA片段识别其同源互补序列的特异性Drosa家族核酸酶包括两个RNase III结构域和一最佳。如果短了会减弱siRNA的识别特异性,太长个dsRNA结合结构域;第三类家族以线虫则较易引起与靶序列的不完全匹配,扩大了siRNAK12H4.8基因编码的蛋白为代表,包括两个攻击靶目标的范围[17]。而3'悬末端则能增强基因RNase II结构域、一个螺旋酶结构域和一个PAZ沉默的效应。此过程还有以下作用:siRNA还能增结构域。其中第三类RNA酶，即Dicer家族,是加细胞内小片段体积克分子浓度,使其有效扩散;dsRNA特异性的核酸内切酶,Dicer在进化上高度Dicer酶将dsRNA降解成片段将不可逆的切断病保守,广泛存在于各种生物中[13]。毒基因组,因此排除了RNAi效应能引发的病毒播2.3RNAi分子机制散的任何可能性;siRNA能与核酸酶有效的形成复近年来，虽然许多科学家运用遗传学和生物化合物,增加细胞内小片段体积。学的方法来探索RNAi的机制,但RNAi是由dsR-2.3.2效应阶段NA诱导的多步骤、多因素参与的过程,其真正的机首先,生成的siRNA双链结合一个核酸酶复合理尚未明了,可能分为以下几个阶段进行(见图1)。物,形成了RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC),具有序列特异性的核酸内a切酶活性,能特异性地降解与siRNA同源的靶mR-DicerNA。虽然核酸酶复合物与Dicer 共有PAZ区,但实MDLAINDM验证明Dicer过程与RISC过程之间是独立的18]。接着激活RISC,这是一个需要ATP依赖的将siRNA解双链的过程,也是RNAi作用过程中消耗的第2个ATP。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mR-NA转录本上,siRNA变性,双链解开,正义链与mR-RISCNA正义链互换,反义链使RISC与同源的靶目标.ActvatonmRNA结合,在核酸内切酶的作用下,距siRNA 3'端by ATP12个碱基的位置将靶mRNA切断,从而阻断了该基m7GAAAAAAA因的表达。Target mRNA靶序列识别具有高度特异性，但并不是siRNAsubstrate反义链.上所有的碱基都对靶序列识别起相同的作用。由于降解过程首先发生在与siRNA相应的中央位置,如果这些碱基位点发生错配，就会阻止靶mRNA的降解。而5'末端对靶mRNA断裂位点的决定性大于3'末端。此外,在引导RISC与靶mR-NA结合时,3'末端倒数第2个碱基起了较为重要图1 RNA1 作用机制的作中国煤化工错配现象[151。2.3.1起始阶段.3YHCNMHG当双链RNA在细胞内达一定量时，dsRNA与SIJ EN T等[1°]发现，细胞中有些siRNA并非Dicer结合,形成酶一dsRNA复合体,在ATP作用来源于dsRNA的降解，而是直接源于细胞内,在下,Dicer先将dsRNA解旋,接着将其切割为5'端RNA介导的RNA聚合酶(RdRP)的作用下的●105●PCR反应,这个反应以siRNA中的一条链为引物,3.6长度依赖性以靶mRNA为模板,扩增靶mRNA,产生新的siR-大量资料显示，长的dsRNA比短的dsRNA介NA亚群(secondary siRNA ,也称为二级siRNA)，导的RNAi更有效,但是这种活性作用与dsRNA二级siRNA表现出明显的极性(反义链5'至3')。长度的增加之间没有严格的正比关系21.27-28]。而这些二级siRNA又能继续反作用于靶mRNA，RNAi对dsRNA长度的依赖性可能是细胞内RNA令其降解1720。这是一个RNAi的循环扩增过程，分子间局部碱基互补,形成较短的dsRNA后避免解释了为什么在线虫中很小剂量的dsRNA就能诱由此而引起异常RNAi的重要基础。发强烈的基因沉默效应。4 RNA 干涉的功能及应用目前进-步研究植物中siRNA在转录后基因RNAi是生物体在进化中形成的-种内在基因沉默和各种形式转录水平沉默中的功能。发现siR-表达的调控机制。就目前的研究来看,RNAi的功NA可能不仅诱导同源mRNA被核酸内切酶破坏，能和应用主要体现在以下几个方面:且可诱导核染色质结构的改变或DNA的甲基4.1病毒防御化[13]。RNAi具有抑制外源基因入侵的功能。最早在3RNAi的分子生物学特性转基因矮牵牛中发现的PTGS现象可以说是该功3.1高特异性能最有力的证据,正是由于外源基因的诱导才有白RNAi的最大特点就在于高特异性。dsRNA色矮牵牛的出现。同时,RNAi还有抑制病毒入侵特异地抑制干扰RNA同源序列的靶基因表达，而的作用.有研究表明在植物叶子，上接种病毒可以使对不相关序列的表达无干扰作用,这是由siRNA的接种部位周围的细胞免疫。科学家发现动物病毒可反义链与mRNA同源区互补配对所决定的21-22]。编码一个RNA干扰的抑制子,支持关于在动物中siRNA除正义链3'端的两个碱基在序列识别中不RNAi可能具有抗病毒功能的概念。从共同进化起主要作用外,其他单个碱基改变就可能使RNAi的角度来分析,说明RNAi也具有抗病毒功能。在失效,而针对同源基因共有序列的RNAi则导致同哺乳动物中的研究发现大于30bp的dsRNA能激源基因共同失活([23]。发干扰素诱导的抗病毒反应，尽管这一过程是非特3.2高速性异性的，但它同样证实RNA i的抗病毒作用。Da-Yang等[24] 将dsRNA注入细胞后10分钟即可vid等研究也发现RNAi是-种古老的抗病毒机制,产生siRNA ,30 分钟内其靶mRNA水平可下降30它可能在转录后水平抵抗病毒感染[29]。倍左右。4.2抑制转座子移动的功能3. 3高稳定性在c. elegans中,参与RNAi的基因发生突变,siRNA分子是3'端有突出的非配对碱基的双将直接导致其传代系中多种转座子元件的激活,说链分子，在细胞内可稳定存在3~4天，半衰期远明RNAi具有抑制转座子在子代基因组中重组扩散长于反义寡聚核苷酸451;另外,RNAi还具有对靶的功能[530]。mRNA的切割位点准确和高穿透性等。4.3调节基因表达3.4高效性目前的实验结果表明广泛存在于生物内的siR-只需少量dsRNA的引入便可抑制浓度是几倍NA/miRNA主要通过两种方式直接调节基因表达:甚至几十倍的mRNA的降解41。许多生物学和1)通过与靶mRNA3'UTR结合抑制其翻译;遗传学证据发现RNAi过程有新的siRNA合成,这2)通过RNAi途径降解靶mRNA。也有证据种合成是以mRNA为模板,以siRNA为引物,在表明内源siRNA可以通过调节染色质的凝集而调RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下产生新的节基因表达:a.裂殖酵母中的内源siRNA可以介dsRNA.dsRNA再被切割为21-23nt的小片段,继导着丝粒区的染色质凝集,从而使凝集区的基因发续发挥靶向降解目的mRNA作用,使RNAi能长时生转录水平的沉默。b. 植物中dsRNA可以通过与间存在并保持较高效能[26]。启中国煤化工导致基因沉默31。3.5可传播性和遗传性4.4:MYHCNMHGRNAi的效应不仅仅局限于单个细胞内，还可RdRP可以催化细胞内的畸变RNA转变成.在细胞之间相互传递和维持效应，甚至可以传递给dsRNA,后者进入RNAi途径被降解。子一代([25]。●1064.5参与基因组重排技术,一次设计并注射多个基因的dsRNA ,则可以在四膜虫接合(conjugation)过程中,siRNA可实现对多个基因的沉默;能通过与染色体上的特异序列的结合导致染色体的2)可对多基因家族的功能进行研究:传统方法断裂和DNA的缺失,这一过程可能与重组区域组不能有效地对多基因家族进行敲除，RNAi技术则蛋白的甲基化有关[31]。可以利用同一基因家族的多个基因的高度保守序4.6用于基因组功能研究列,设计针对这一保守序列的dsRNA ,注射这一随着越来越多生物全基因组序列的公布，了解这dsRNA分子即可产生多基因家族中多个基因同时些基因在生长和发育中的作用越来越受到人们的关剔除的表型;注。人类已进入后基因组时代,需要大规模高通量的3)方法简单、方便:dsRNA分子既可通过基因研究基因的功能。由于RNAi能高效特异的阻断基转化，也可通过注射，甚至喂饲转录dsRNA的细菌因的表达,因而RNAi成为研究基因功能的很好的强将dsRNA转入到目标生物中，得到高效的RNA干有力工具。例如: Fraser等和Gonczy等构建了1个涉表型,而且抑制基因表达的时间可以随意控制在线虫第1.第2号染色体上基因的细菌文库,用表达目标生物发育的任意时期327dsRNA的细菌喂饲线虫幼虫,分别使第1染色体上4.7用于生物遗传改良90%.第2染色体上96%基因沉默，通过表型分析RNAi方法在植物遗传及发育等研究领域同样和序列分析,了解了第1染色体上13.9 %的基因功得到了广泛的用。A rabidop sis thaliana 是植物遗能,识别了许多染色体动力学、细胞结构、特异转录和传和发育研究领域很重要的模式生物，Cioppa等人信号传导所需基因以及第2染色体上133个在早期用烟草的mosaic病毒导入了几千种不同的遗传序胚胎发育不同阶段所需要的基因。列,系统地进行基因敲除来筛选有用的性状，如抗Hanazawa等将RNAi与SSH技术相结合,研病或耐旱。Gutterson 等人敲除了康乃馨的一种激究与线虫精子发育相关的基因。他们将具有差异表素,使花期延长。多聚半乳糖醛激酶在西红柿成熟达的168克隆cDNA通过PCR扩增,再用T3RNA时消化细胞壁，Zenera 实验室将它敲除后，西红柿多聚酶和T7RNA多聚酶转录分别转录成dsR-可晚一些采摘，味道变得更为鲜美NA,然后,将dsRNA分别注射到线虫的内肠中,分4.8用于基因治疗,抑制有害基因的表达析各个体的表型。鉴定了15个引起个体不育的基从理论上讲，针对有害基因序列设计dsRNA,因,其中8个与卵子发育有关,3个涉及到卵母细胞将dsRNA导入生物体内或让dsRNA在生物体内发育，4个与精子发育相关。Misuitta等通过注射转录,利用dsRNA引发其同源内源有害基因的nautilus dsRNA于果蝇胚胎中,发现其表现型与没mRNA序列的降解,从而可达到抑制该有害基因表有nautilus表达的细胞表型相似，肌肉不能形成,从达的目的532]。而确立了nautilus在果蝇胚胎肌肉形成中的功4.9用于缓解或消除肿瘤能[58]。与此同时,哺乳动物中非特异性RNAi效应大多数肿瘤的发生与基因改变有关,主要表现的克服和新型表达载体的问世,将RNAi技术用于在癌基因的突变、扩增、过度表达以及抑癌基因的突哺乳动物的基因功能的研究推上了应用的前沿。当变、失活等方面。传统技术诱导的单个癌基因的阻前,利用RNAi技术,人们已在多种哺乳动物细胞断往往不可能完全抑制或逆转肿瘤细胞的生长,因(CHO、Hela、293、293T、T细胞)中成功地降低此也很难达到预期的治疗效果,而RNAi技术则不( Knockdown)了靶基因的表达,这些被降低了的基同,它能够同时抑制多个不同的基因,而且抑制效果因范围广泛,既有结构蛋白编码基因,也有催化蛋白互不干扰。RNAi可以利用基因家族中多个基因具编码基因,而靶基因降低的幅度则高达85%一有-段同源性很高的保守序列这-特性,针对这一99 %[33]区段序列设计相应的dsRNA分子,dsRNA分子产利用RNAi进行基因功能研究具有许多传统方生方式可以采取体外人工化学合成和构建在体内表法所不具备的优点:达中国煤化工< short harpin RNA .1)高效性:RNAi引起相应基因沉默的频率比shR:fYHC N MH G只需要注射一种dsR-传统的方法要高出10倍甚至上百倍;同时,传统的NA分子即可产生多个基因同时剔除的表现;当然.基因敲除技术和DNA/RNA嵌合分子介导的基因也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关转变技术，一次只能研究一个基因，而利用RNAi的基因同时剔除[55]。4.10用于信号传导通路的研究versible co-suppression of homologous genes in trans综合利用传统的缺失突变技术和RNAi技术可[J]. plant cell. 1990,(2) :279 - 289.以确定复杂信号传导途径中不同基因的上下游关[2] JORGENSEN R A，CLUSTER P D，NAPOLICA.Chalcone synthase co一suppression phenotypes in petu系。Clemensy等应用RNAi研究了果蝇细胞系中nia flowers : comparison of sense vs. antisense constructs胰岛素信号传导途径,取得了与已知胰岛素信号传and single - copy vs. comeplex T - DNA sequences[J]. .导通路完全一致的结果,在此基础上他们还分析了Plant Mol B ol, 1996 ,(31):957- 973.DSH3PX1与DACK之间的关系，证实了DACK[3] 雷迎峰. RNAi研究进展.国外医学分子生物学分册是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶[31]。[J]， 2002 , 24 (4) : 196-199.4.11药物筛选[4] Fire A，XuS，Montgomery MC et all Potent and spe-cific genetic interference by doublestranded RNA inRNAi在药物开发中也大有作为,可作为鉴定.Caenorhabditis elegans ，Nature , 1998，391 : 806-药物靶位及药物筛选的工具。RNAi极大地缩短了811.从鉴定靶基因到认识其功能的时间,促进了药物发[5] Waterhouse P M, Graham M w, Wang M B1 Virus re-现过程中对已知靶基因功能的高通量分析。已有人sistance and gene silencing in plants can be induced by将RNAi技术与基因表达谱相结合,用于药物特异simultaneous expression of sense and antisense RNA1性及其作用机制的评估,以期在药物开发过程中能Proc Natl Acad Sci USA，1998 ，95 : 13959 - 13964.[6] Vander KrolA R，Flavonoid genes in petunia : addition较快地鉴定出更好的侯选分子[33]。of a limited number of gene copies may lead to a sup-5展望pression of gene expressionl Plant Cell，1990，2，291虽然传统的功能基因筛选方法能产生可保存的突变体，但基因定位克隆又慢又费力。而基于[7] Cogoni G, Macino G1 Gene silencing in Neurospora cas-RNAi筛选的优点(尤其是细菌文库的优点)，它将sa requires a protein homologous to RNA- dependentRNA polymerase1Nature，1999 ,339 : 166- 169.会被越来越多地使用。在哺乳动物细胞中应用siR-NA的报道虽不多，但也证明siRNA具有特异性抑[8] Ngo H，Tschudi C，Gull Ket all Double - strandedRNA indeuces mRNA degradation in Trypanosoma bru-制基因表达的作用。已有证据表明siRNA介导的ceil Proc Natl Acad Sci USA，1998 ，95 : 14687RNAi能特异性抵御病毒等病原生物的入侵，拮抗14692.植物肿瘤发生作用。RNAi 技术作为反向遗传学技[9] Sanchez 一Alvarado A，Newmark P A，Double术已经越来越受到广泛的重视，解决了技术上的难stranded RNA specifically disrupts gene expression dur-题，RNAi技术便可以用于产生大量的缺陷型个ing planarian regenerationl Proc NatlAcad Sci USA1999 , 96 : 5049- 5054.体，并对大量的表型突变体进行分析，从而更进-[10]Pal - Bhadra U , BirchlerJ A . Cosuppression of non-步运用到研究果蝇体内许多基因，特别是一些看守homologous transgenes inDrosophila involves nutuallyu基因的研究以及更为深层的组织系统如神经系统等related endogenous sequences ,Cell ，1999，99 : 35-的研究。RNAi和siRNA的发现产生了一种新的功能基因组研究策略，可见RNAi在后基因组时代[11] LohmannJ U，EndlI，Bosch T C，Silencing of de-velopmental genes inHydral Dev Biol，1999 , 214 :规模性基因功能研究中具有广阔的应用前景，同时211-214.还有可能研究出基于RNAi的基因治疗药物。尽管对RNAi的研究有一个良好的开端，但还[12] Wianny F，Zernicka G M1 Specific interference withgene function by doublestranded RNA in early是有大量的问题有待科学家们去解答。如在细胞浆mouse developmentlNat Cell Biol ,2000 ，2(2) :70内发生的、转录后的RNAi是否与核内的转录沉默一75有某种联系，RNAi是否与转录水平相偶联，RNA[13]岳枫,马文丽，郑文岭、RNAi的不同沉默机制及其应逆向信息传递反作用于DNA，生命的信息是否起用[J].生物技术通报,2004,(3):5-7.源于RNA,如何更有效地将siRNA导入哺乳动物[14] NICHOLSON R H ,NICHOLSON A W. Molecular char-中国煤化Iencoding Dicer ,a ribonucle-细胞，进行基因功能研究以及疾病基因治疗。DHCNMH G. interference[J] . Mann Ge-参考资料:none，2002，13(4) :01- 13.. [15] ELBASHIR s M, HARBORTH J , WEBER K,et al.[1] NAPOL 1 C. LEMIEUXC. JORCENSEN R. 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Here the mechanism and application of RNAi are reviewed.Key words: RNA interference; co- suppression; functional genomics; double- stranded RNA ( dsR-NA); small interfering RNA (siRNA); gene silencing.中国煤化工MHCNMHG