聚乙二醇在植物渗透胁迫生理研究中的应用

植物生理学通讯第40卷 第3期，2004年6 月361聚乙二醇在植物渗透胁迫生理研究中的应用张立军樊金娟'阮燕晔1关义新2'沈阳农业大学生物科学技术学院，沈阳110161; 2中国农业科学院作物育种栽培研究所，北京100081Application of Polyethylene Glycol in the Study of Plant Osmotic StressPhysiologyZHANG Li~Jun", FAN Jin~Juan', RUAN Yan-Ye', GUAN Yi-Xin2'ollege of Biological Science and Technology. Shenyang Agriculural Universit, Shenyang 1161:1nstinte of Crop Bredingand Cultivation, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Bejing 100081提要介绍聚二醇(PEG)在调节培养液和固体培养基水势以及在水分胁迫和盐胁迫研究中的应用及应注意的问题，并介绍PEG溶液水势的测定方法和水势计算公式.关键词聚乙二醇;植物;渗透胁迫;水势计算.植物在生长发育过程中，经常会遇到由干旱大分子的质量!)，以及促进种子萌发4-61等。和高盐引起的渗透胁迫。受到渗透胁迫的植物脱2 PEG水分渗透胁迫研究中的应用水，细胞膨压丧失，对植物产生许多不利效应:在研究植物对干早和高盐的反应时需要低水发育受抑，生产力降低，甚至死亡。长期以来，势处理。-般的做法是减少土壤或其它固体培养人们一直想通过揭示渗透胁迫伤害机理，寻找提基的水分供应，但在整个实验期间很难保持水势高植物抵抗胁迫能力的途径。但在研究过程中常的恒定和一致。而且有些试验，例如要求严格控为一些客观因素所困扰:-是 土壤的组分非常复制培养基水势、需要在短时间内使植物体达到较杂，作为实验系统常难以控制:二是有时难以将低水势、在实验过程中需要进行放射性标记的实渗透胁迫效应与土壤系统中的其它胁迫效应有效区验不适合用固体培养基培养植物，而用液体培养分开。因此，在植物渗透胁迫生理研究中，实则较为合适。此外，在观察渗透胁迫对植物根系验能否在一个稳定而易于控制的模拟系统中进行就生长和形态变化的影响时，溶液培养也有较大的显得十分重要。聚乙二醇(polyethylene glycol,优势。PEG)溶液培养则是人们在进行植物渗透胁迫研究2.1 PEG溶液培养的特点及应用用溶液培养对植中一个常用而比较理想的系统。物进行渗透胁迫时，需要调节培养液的水势。如1PEG的性质.果单从调节水势的角度考虑，无机盐、小分子的PBG是乙醇聚合物，分子式为HOCH2 -[CH-糖、 醇等都可以选用。但对土壤干旱来说，不0- CH2]. - CH2OH，分子量有200~20 000不等。仅要使植物的细胞脱水，而且还要使细胞壁脱常见商品的分子量在200~8 000之间，pH 5~7,溶水。因此，模拟土壤干旱的渗透物质，其分子于水，也溶于大多数有机溶剂。随着分子量的增量要足够大，才能不透过细胞壁，产生与土壤干大，PEG 的物理性质也随之变化，从无色无味的旱相同的脱水效应。如果渗透调节物质透过细胞液体变为蜡状固体。由于PEG的性质特殊，在很壁，甚至透过细胞膜进入细胞内部，被代谢或产多行业中都有广泛的用途。如橡胶、纺织、金生其它效应，将会使研究的问题复杂化。属等行业中用作水溶性润滑剂、软化剂、不饱和Greenway”对液泡化和非液泡化的玉米组织进行渗树脂等。PEG分子有非离子化的长链，化学性质透胁迫时，发现复水后液泡化组织的代谢物外渗不活泼川，对生物的毒性很小，所以也应用于制速率讯迪增士，而非滴泊化的细纠织内含物外渗只药业、化妆品业和医疗中。在生物科学研究中中国煤化工PEG也有广泛的应用。例如，PEG用于介导细胞JYHCNMH G,融合、DNA转移，分离生物大分子42和测定生物B-mail: ljzhang@sya.cdu.cn, Tel: 024-88443713362植物生理学通讯第40卷 第3期，2004年6月有轻微的增加。因此，溶质是否能够透过细胞壁些物质不适合较长时间的渗透胁迫实验119。PEG对植物细胞的效应是不同的8。PEG可作为渗透可以应用于长时间的植物渗透胁迫实验，但在配调节物质9。实验表明，分子量在6 000及6000制培养基的过程中，如果将PEG直接加入培养基以上的PEG不能透过细胞壁。当细胞置于低水势中会干扰琼脂糖凝固，从而限制PEG在固体培养溶液中，细胞内水分流出，细胞体积变小，如植物的渗透胁迫生理研究中的应用。Linossier 等201果溶质的分子量很小，可以透过细胞壁，则会引在研究PEG和脱落酸对橡胶树(Hevea brasisliesis)起质壁分离(plasmolysis);如果溶质的分子量很大，体细胞胚发育的影响时， 向培养基中加入75、 140不能透过细胞壁，水分的移出则会使细胞发生塌和178 g:L'的PEG3350溶液(其水势分别相当于陷(cyorrhysi)。Carpita 等101用溶质分子量不同的58、174 和290 mmol:L"1的蔗糖溶液),在制备培溶液处理活体细胞时发现，甘露醇、PEG2000 引养基时，将上述浓度浓缩1倍，在120C下灭菌起质壁分离，PEG6000 引起塌陷，PEG4000 既20min后，再分别与浓缩1倍的不含激素的MH引起质壁分离又导致塌陷。所以，高分子量的.(Mueller-Hinton)培养基等体积混合，配制时先将PEG是模拟土壤干旱理想的水势调节物质。PEG 溶液倒入到培养基中，然后再使培养基凝Rashmi和Agaral"l在实验中还发现，用水势为固。但应该注意的是，PEG经过高温灭菌后，水-1.7和-2.1 MPa的PEG6000(0.27和0.3 gg水)和势会发生变化，因此实验过程中应考虑到这种变甘露醇(0.3和0.6 mol:L')处理水稻幼苗时，胁迫化的影响。van der Weele等建立了一种简便的诱导的脯氨酸含量增加，前者明显大于后者。方法，即将经无菌过滤的PEG溶液倒在已经凝固有人用PEG产生渗透胁迫处理玉米1213]、水的琼脂培养基上，平衡一夜后倒掉PEG溶液，再稻14)的幼苗时发现，各种植物表现出相同的特接种植物材料。此法不仅能够满足实验对于水势征:丙二醛含量增加，叶中相对含水量(RWC)下的要求，而且对植物没有毒害作用。降，膜透性增高。此外，随着植物抗性生理研3 PEG在研究盐胁迫中水分胁迫的作用究向细胞水平的深入，需要以离体的器官、组织虽然盐胁迫的一-个主要效应是对植物产生渗和细胞为试材进行研究。范建民和惠玉琴15以不透胁迫，其对植物的伤害与土壤干旱有共同的机同苗龄的小麦离体叶片为材料，研究PEG对其衰制，但是盐胁迫还会产生离子毒害等其它效应。老的影响时，发现PEG加速小麦衰老。同样，在无机盐离子分子量小，不仅能透过细胞壁，而且细胞水平的研究中，PEG也是- -种很好的水势调可被细胞所吸收，在细胞内积累将会影响酶和其节物质。例如，Bajji 和Chaumontl!6)就曾采用离它蛋白的稳定性。因此，在研究盐胁迫机理时应体组织研究渗透胁迫对细胞膜离子通道、水孔蛋将盐胁迫的渗透胁迫效应与其它效应区分开。白和其它转运蛋白的影响。许多学者用PEG进行研究时，发现植物体在近年来，随着分子生物学的发展，PEG 渗透遭遇盐胁迫和渗透胁迫时，在许多反应上有差胁迫也用来研究基因的表达和调节7”问题。在许异。Skrecky22)用-1.0 MPa的非透过性溶质多植物中，蔗糖合成酶基因的表达受蔗糖所制PEG8000和透过性溶质氯化钠处理假单胞菌约。Dejardin 等[181研究表明，拟南芥的蔗糖合成(Pseudomonas putda)后置于透射电镜下观察，发酶基因(Sus1)表达由蔗糖所诱导外，还可以由透过现经PEG处理的细胞外膜出现断裂或皱褶，而用性溶质(山梨醇、甘露醇)和非透过性溶质氯化钠处理和未经处理的细胞中则没有。Bajji 和PEG8000所诱导。因而推断Sus1基因可能受渗透Chaumont!l用29% PEG6000和300 mmolL'氯化势调节，而不是受蔗糖代谢物的调节。钠(约-1.5 MPa)胁迫玉米幼苗时发现幼苗鲜重显2.2 PEG固体培养的特点及应用在某些植物渗透著降低，PEG处理的降低程度大于氯化钠处理胁迫研究中需要在琼脂培养基上培养幼苗或离体组的，而且PEG处理的叶中相对含水量降低，幼苗织，并进行渗透胁迫处理。通常的方法是在培养中国煤化工相对含水量恢复正基中加入小分子的糖类、醇类物质或无机盐，如YHCN MH G水量不降低，但在蔗糖、甘露醇、山梨醇等进行渗透胁迫。但这转矽到止吊水劳浴液中后，相对含水量则降低。植物生理学通讯第40卷 第3期，2004年6月363假单胞菌的反式不饱和脂肪酸与顺式不饱和脂肪酸中不遵循van' t Hoff定律，对于给定的PEG水的比值对PEG8000、PEG200和氯化钠渗透胁迫势与摩尔浓度有关，但不成线性关系。在相同摩呈不同的反应:在-0.25 MPa水势下，PEG200尔浓度下，水势随着分子量的增大而降低。PEG和氯化钠处理的反式不饱和脂肪酸与顺式不饱和脂的水势可能主要受乙醇亚单位的衬质势控制。肪酸的比值高于PEG8000处理的;水势进-步下虽然PEG溶液的水势与摩尔浓度不呈线性关降时，PEG8000才诱导产生大量的反式饱和脂肪 系。但Michel和Kaufmannl281发现在一 定范围内，酸，导致其与顺式不饱和脂肪酸的比值上升122]。PEG 溶液水势随浓度和温度的变化，可用方程马焕成和王沙生23用等渗透势的氯化钠和PEG溶4=aq[PEG]2 T+b(PEG] +c[PEG]T+d([PEG]描述，式液处理胡杨时发现，胡杨对渗透胁迫和盐胁迫有中a、b、c、d为常数。Michel 等1291983年又不同的响应:处理1 d后，受-0.24 MPa的氯化推导出如下经验公式，对PEG溶液的水势进行计钠胁迫的胡杨根中ABA含量比未经氯化钠胁迫的算或预测: YpEo=1.29[PEG]' T- 140[PEG]2-处理增加2.7倍;而用相同水势的PEG处理没有4[PEG]。式中，YpEG 为PEG溶液的水势，单位影响。李海云等1241研究盐生植物滨藜(Atriplex为 bar; [PEG]为PEG浓度，单位为g:g'(水); T为isatidea)、碱蓬(Suaeda salsa)、海蓬子(Salicomia温度(摄氏度)。此公式在PEG浓度0~0.8 g:g"'(水)、eucopca)、 补血草(Limonium bicolor)种子萌发的抑温度5~40C的范围内可得到很好的预测结果，误制因子时发现，虽然氯化钠和等水势的PEG6000差在5%以内;但在预测高浓度PEG溶液的水势都对种子萌发有抑制作用，但PEG6000的抑制作时，误差增大。用大于氯化钠。这都说明非透过性的PEG胁迫和甘露糖和葡聚糖的水势计算可参见文献29。盐胁迫有不同的机制。应该注意的是，PEG 与低分子量溶质混合时总之，用PEG产生渗透胁迫是盐胁迫生理研对水势的影响具有加成效应。例如将PEG与究中的一个重要手段。在实验过程中，可以针对K2SO、NaCl、 甘露醇混合时，实测水势低于预不同的实验目的，用不同分子量的PEG,产生不测水势(比预测水势更负， 表1).这为培养液水同性质的渗透胁迫来研究细胞壁外脱水和细胞膜外势预测带来了困难。但这个公式可应用在对水势脱水效应。精确度要求不高的实验中，也可以在此基础上对4 PEG溶液水势的测定和计算水势进行进一步 的精确调节。PEG溶液水势可以用冰点下降法(freezing-5结束语point depression)和水蒸气压亏缺法(vapor- pressure虽然PEG广泛应用于植物渗透胁迫的溶液培养deficit)测定[326。但这两种测定方法的结果有较中，但还存在着-一些问题。首先，氧气供应不大的差异。Williams 和Shaykewich7发现PEG在足，以致植物缺氧。这与一般溶液培养一样118]。低浓度[ 50~150 g(1 000 g)"(水)]下，冰点下降法在纯水中氧气的传递能力比空气中低10^倍1,而的测定结果比水蒸气压亏缺法高(负的少)26% ~且在进行溶液培养时根系表面还存在着影响氧气扩44%;高浓度[300~400 g*:(1 000 g) "(水)]下比水散的界面层2，层面层的厚度与搅拌程度和溶液蒸气压亏缺法低(更负)14%~20%。PEG在水溶液的粘度有关。溶液的粘度愈大，愈不利于氧气的表1盐和甘露醇对PEG溶液水势的影响0PBC/gg'(水)溶质浓度/mol.L:1.20.3实测水势Mpa加成效应Mpa 实测水势Mpa 加成效应Mpa 实测水势Mpa 加成效应Mpa中国煤化工-K,SO,0.355-2.00NaCl0.410-1.99YHCNMHG0.62甘露醇0.731-1.95-2.760.50-3.370.75364植物生理学通讯第40卷 第3期，2004年6月扩散。PEG溶液的粘度较大，对根系的氧气供应Biochem, 2002, 110 (5); B1-B42有较大的不利影响，从而增大了根系缺氧的可能17 Stasolla C, van Zyl L, Egersdotter U et al. The efets of poly-ethylene glycol on gene expression of developing white spruce性。其次，对培养植物产生伤害。在培养过程somatic embryos. Plant Physiol, 2003, 131(1): 49-60中，PEG有时会进入组织内部，对植物尤其是植18 Dejardin A, Sokolov LN, Kleczkowski LA. An Arabidopsis物的根系产生不同程度的伤害1331。此外，如果stress-responsive sucrose synthase gene is up-regulated by lowPEG本身纯度较低，其所含有的杂质也会对植物osmotic potential. Abstract Number769. abstracts.aspb.org/aspb1998/48/0373.shtml产生一定的伤害作用1341。这些都是我们在应用19 Verslues PE, Ober ES, Sharp RE. Root growth and oxygen rela-PEG的实验中需要加以注意的。tion at low water potentials impact of oxygen availability in poly-ethylene glycol solution. Plant Physiol, 1998. 116: 1403-1412参考文献20 Linossier L, Veisseive P, Cailloux F et al. Effect of abscisic acid1 Couper A. Eley D. Surface tension of polyethylene glycoland high concentaions of PEG on Hevea brasiliensis somaticsolutions. J Polymer Sci, 1948.3:354~349embryos development. Plant Sci, 1997, 124: 183-1912 McClendom JH, Blinks Lr. 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