腺苷的合成与应用

Vol. 12,No.19精细与专用化学品第12卷第19期●12.Fine and Specialty Chemicals2004年10月6日新品介绍腺苷的合成与应用施庆珊*许虹林小平邱玉棠(广东省微生物研究所,广东省菌种保藏与应用重点实验室,广东广州510070)摘要:腺苷是一种重要的医药原料,在医药工业中有很多重要的用途。本文介绍了腺苷生产的两种主要方法,即生物合成法(发酵法或RNA降解法)和化学合成法。其中采用糖质原料直接发酵生产腺苷的成本最低,但在国内此方法尚未完全成熟,国内目前主要仍以化学合成法为主。此外,还简要介绍了腺苷在医药工业方面的应用和市场发展前景。关键词:腺苷;生物合成;化学合成;医药原料Synthesis and Application of AdenosineSHI Qing-shan, XU Hong, LIN Xiao-ping, QIU Yu-tang(Guangdong Institute of Microbiology , Guangdong Provincial Key Laboratory ofMicrobial Culture Collection and Application, Guangzhou 510070, China)Abstract: The adenosine is a kind of important pharmaceutical raw materials ，and it is applied in pharmaceutical in-dustry widely. In this paper, two main methods i. e. chemical synthesis and biosynthesis ( by fermentation or by decomposi-tion of ribonucleic acid) for production of adenosine are introduced. Among these methods, cost of the direct fermentationof sugar is the lowest to produce adenosine, but this method has not been tally perfect in China. At present, the produc-tion of adenosine still relies mainly on chemical synthetic method domestically. In addition, the applications of adenosine inmedicine and market prospect are introduced briefly.Key words: adenosine; biosynthesis; chemical synthesis; pharmaceutical raw material腺苷是一种天然存在的遍布人体细胞的内源性法主要有发酵法和RNA降解法两种，由于发酵法生嘌呤核苷,是三磷酸腺苷(ATP)的降解产物。腺苷产腺苷有成本.上的优势,因此是今后腺苷生产的发以其扩血管作用而被人们所熟知，除具有广泛的心展方向。本文以腺苷产生菌为例,详细介绍腺苷的脏效应以及快速显著的冠脉扩张作用外,还具有触发酵生产法,同时简要介绍了RNA降解法和化学合发或介导缺血预适应、减轻再灌注损伤等心脏保护成法。效应。在美国,腺苷是经FDA批准的转复阵发性室1理化性质上性心动过速(PSVT)的一线药物,也是经FDA批准的用于心脏药物负荷试验的两种药物之一,已成腺苷(Adenosine)学名腺嘌呤核苷(9-B-D-Ribo-为急诊处理快速性心律失常和药物负荷试验的常规furanosyl adenine), 分子式C， H, N,0,分子量用药。同时,腺苷还是一种重要的医药原料,利用腺267. 24,结构式如图1所示;为含1.5分子水的无色苷可制成许多药物如ATP、环腺苷酸、阿糖腺苷等。针状结晶,于100C真空处理失去结晶水。有微咸自从1909年首次从苦味酸盐中提取出腺苷后，苦味,易溶于水,几乎不溶于醇和醚,易为稀无机酸其合成和应用就得到了广泛的研究。腺苷的合成总水解得到腺嘌呤和D-核糖,熔点234 ~ 235C,比旋的来说可分为生物合成法和化学合成法,生物合成度[a125-61011 0水). nK3.5(碱性基团)，中国煤化工THCNMHG*收稿日期: 2004-07-21基金项目:广东省科技攻关项目腺苷产生菌选育及发酵工艺研究(项目编号2002C1040103)资助。作者简介:施庆珊(1966- ),男,副研究员,从事工业微生物菌种选育及发酵工艺的研究和开发工作。2004年10月6日施庆珊,等:腺苷的合成与应用●13●12.5 (酸性基团)。有紫外吸收，紫外吸收数据见活化培养基(g/L):葡萄糖20,尿素4,玉米浆6,蛋表1。白胨10,酵母膏10,鸟嘌呤0.025,pH7.0;发酵培养NH基(g/L):葡萄糖120,玉米浆12,药用酵母粉18,硫酸铵10,磷酸二氢钾1,硫酸镁1,pH7.0。HO-(3)发酵工艺、菌种在保 藏培养基培养24h后,接入装有20mL液体活化培养基的500mL三角0H 0H瓶(0. 07MPa灭菌10min)中,32C于往复式摇床(振图1腺苷的化学结构幅72cm、频率100r/m)振动培养15h。液体种子按5%接种量接入装有20mL发酵培养基的500mL三表1腺苷紫外吸收数据角瓶(0.1MPa灭菌15min)中,32 ~ 36C于往复式摇H1.2床(振幅76cm、 频率100~ 120r/m) 振动培养72 ~λ最大/mm25726096h,同时,在发酵至4~6h时,用16%(v/v)氨水&最大x10-314. 9g260 x 10-314. 3调节发酵液pH至7.0,发酵至12 ~60h时,用16%λ小/nm230227(v/v)氨水调节发酵液pH至6.0。发酵结束后,产0. 840. 78物可用离子交换树脂或用超滤膜提取。用此方法进As20/A2600.220.14A20/A260 .0.030行发酵,腺苷最大生成量可达18g/L。2.2 RNA 降解法RNA(核糖核酸)是生命存在的物质基础,几乎2生物合成所有的生物体内都含有RNA(某些病毒除外),从微2.1 发酵法生物中提取RNA是工业上最实际和有效的方法。1937年,Hemut等[")报道了通过发酵得到核苷-些最常见的微生物菌体中含有丰富的核酸资源，酸,再进行酶解得到腺苷;1954年,John等12)用腺嘌如啤酒酵母、纸浆酵母、石油酵母、糖蜜培养的面包呤和肌苷通过大肠杆菌发酵,用游离细胞法得到了酵母、综合利用生产的白地霉、抗菌素(如青霉素)腺苷;1965年,奥村(3)用芽孢杆菌为产生菌进行腺菌丝体等。在较系统筛选的某些酵母菌(所谓的高苷发酵,生成量为1.1g/L ;1968年,小西真八等(4)核酸酵母)如白假丝酵母(Candidautili)、啤酒酵母使用枯草杆菌的异亮氨酸缺陷型在含有异亮氨酸(Sarcharomyces Cereisiae) ,以糖蜜和醋酸为碳源，培0.03%的培养基中积累1. 26g/L的腺苷(最高可达养过程中加入氣化铝或硫酸铝,pH控制在4.5,菌2.45g/L);1976年,中山清']用耐2-氟腺嘌呤的产体RNA含量可高达16%以上。氨短杆菌ATCC21709在适当的培养基中振荡培养RNA降解法生产腺苷主要包括几个步骤:96h,腺苷生成量为2. 1g/L;1986年,美国的Howaird(1)RNA粗品的制备培养好的 菌体离心收集ML等l6)用酵母菌进行腺苷发酵的研究,产量小于后,用10%干菌体、10%NaCl、90~100C高温抽提,5g/L;用发酵法生产腺苷最成功的是日本的Haneda.抽提液可用超滤分离出RNA,也可用苯酚沉淀蛋白等'),他采用芽孢杆菌P53-18菌株以葡萄糖为原料质,离心,去沉淀,取上清液用乙醇沉淀,收集沉淀物进行发酵,腺苷最大生成量达16g/L。下面以本研干燥后即得到RNA粗品。究组筛选的腺苷产生菌(芽孢杆菌突变株)为例,详(2)RNA的酶解RNA0. 5%、酶液(如桔青霉细介绍腺苷的发酵法生产。酶液)10%(v/v)、pH5、温度70 ~75C、降解2h,得(1)菌种肌苷产生菌枯草芽孢杆菌CMI-到4种单核苷酸混合物。741(8)为出发菌株,通过多因子诱变选育出具有黄(3)核苷酸混合物分离用离子交换树 脂分离嘌呤缺陷型、丧失腺嘌呤脱氨酶的腺苷产生菌CMI-出AMI中国煤化工Xn200(Xan^)。YHCNMHG年H为5.0或(2)培养基保藏培养基(g/L):蛋白胨4,牛5.5条件下,5*-AMP回流40h脱去磷酸根得到腺肉膏14,酵母膏7,鸟苷0.05,琼脂20,pH7.0;液体苷, 产率为80%。精细与专用化学品第12卷第19期氣-9-<(B-D-2' ,3' ,5'三乙酰基呋喃核糖)嘌呤[12);3化学合成最后氨解步骤同由次黄嘌呤合成腺苷的一样。3步腺苷的化学合成方法很多,如:①由2, 8-二氯反应的总收率约为50% ~60%。 合成路线如图3嘌呤合成腺苷;②由2-甲基硫代腺苷合成腺苷;③所示。由5-胺4-氰基-1-眯唑_D-核糖呋喃或其衍生物合成OFOH腺苷;④由8-巯基-9-甲基腺嘌呤合成腺苷;⑤由.2' ,3' ,5'三乙酰基次黄苷合成腺苷。上述方法起始原料价格较贵,难以应用于大规模合成中。由于HOH2C、0、 |AeOH2C、0近几年来,国内肌苷发酵水平大幅度提高,肌苷生产POCI3成本已下降到5万元/t左右,因此以肌苷为起始原HO OHAcO OAc料进行腺苷的合成目前已进入工业化生产阶段;另CI外,以肌苷为原料合成抗病毒药物三氮唑核苷( Ribavirin,利巴韦林)时,有大量副产物次黄嘌呤产生,因此,以次黄嘌呤为原料合成腺苷在成本上也是AeOH2C、s可行的。CHgOH-NH，， 腺苷3.1由 次黄瞟呤合成腺苷AcO 0Ac由次黄嘌呤为起始原料合成腺苷时,首先次黄图3由肌苷合 成腺苷的路线嘌呤与三氯氧磷( POCI,)反应制得6-氯嘌呤,6-氯嘌呤再与四乙酰核糖在特制的催化剂作用下发生缩4应用与展望合反应(130 ~ 140C),生成缩合物6-氣-9-(B-D-2',腺苷作为药物，由日本藤泽药品工业公司( Fu-3', 5'-三乙酰基呋喃核糖)嘌呤,缩合物在0C饱.jisawa)的子公司Lyhomed于1989年首先投人美国和的氨甲醇作用下氨解(100C,氨解10 h。)制得腺市场,随后又在英国、比利时、法国等多个国家获得苷,3步反应的总收率约为45%。合成路线如图2批准,在美国,目前腺苷的年销售额约3000万美元。所示(10)。在国内，以腺苷为原料生产腺苷制剂的厂家比较多，0Cl Ac0- \ OAc如沈阳光大制药有限公司生产的腺苷注射液，法国P0C]z .OAc OAc的SamifeWintrp公司曾于1996年在我国申请腺昔注射剂品种的注册登记。另外,腺苷也是合成其它.核苷类药物的中间体,利用腺苷可制成许多药物如C嘌呤霉素、高瓜氨基腺苷、赖氨酰氨基腺苷、琥珀酰-5' -腺苷酸、S-腺苷蛋氨酸、腺苷乙硫氨酸等核苷类AcO- pNH,-MeOH腺苷抗菌素,由于它们是肽合成的抑制剂,具有广谱抑菌OAc 0Ac作用,可用于治疗乳腺癌及其他病毒性疾病等()。图2由次黄嘌呤合成腺苷的路线利用腺苷为原料还可合成阿糖腺苷、单磷酸阿糖腺3.2由肌苷合 成腺苷苷(Ara-Amp)、ATP 、环腺苷酸等药物。其中,阿糖20年前,肌苷发酵水平很低、价格很高,是由腺腺苷现市场价60万~80万元/kg,有广谱的抗DNA苷在亚硝酸作用下脱氨而产生的;而现在情况相反，病毒、RNA病毒活性,用于抗单纯疱疹病毒HSV-1是以肌苷为起始原料合成腺苷,合成过程主要包括和HSV-2;本品的单磷酸酯(单磷酸阿糖腺苷)有抑酰化氯化和氨解3个步骤。酰化主要是为了保护中国煤化工于治疗肝癌;环腺核糖上的3个羟基,-般用肌苷与醋酐-冰醋酸进行营酸YHCNMH包分化、癌变、逆转.乙酰化反应"，制成三乙酰肌苷;然后在三氯甲烷等多种生理生化过程,具有重要的调节控制作用,是中用氯亚叉进行三乙酰肌苷6-羟基的氯化,得到6-一种 效果明显、毒副作用较小的非强心苷类药物,现2004年10月6日施庆珊,等:腺苷的合成与应用●15.市场价7万元/kg;ATP(三磷酸腺苷)是生物体内能物8-氯腺苷等,因此,它具有广阔的市场和发展前量代谢的重要中间物质,它作为能量的载体可将分景。口解代谢所获得的能量传递给合成代谢系统,在生物参考文献体内的能量交换中,占有中心地位,临床上可用于治[1] Hellmut B. Adenosine( P]." CE 650 874,1937疗心脏病、脑动脉硬化及肌肉萎缩等症,目前市场价[2]- John 0. Formation of adenosine by ellftee extacts of escherichiacoli[J]. Arch Biochem Biophys, 1954, 48: 483 ~ 484每吨100万元左右,年需要量约为150t。[3)奥村.特许公报24278,1965腺苷原料目前国内的市场价为60万~70万[4) s Konishi, K Kubota, R Aoki,et al. Amino Acid and Nucleic Acid元/t,采用糖质原料直接发酵生产腺苷成本最低,如1968，18 (15)果发酵水平达到20g/L以上,提取总收率80%以(5].中山清(协和发醇).特许公报15115, 1976上,则生产成本可控制在10万元/t以下。与日本旭( 6] Howard M, Laten. Production of adenosine by mutants derived fromyest[J]. Journal of Bacteriology，1986 , 168(3):763 ~ 768化成公司相比,国内发酵法生产腺苷起步较晚，目前[7] K Haneda, A Hirano, R Kodaina, et al. Accumulation of nucleie有2 ~3家研究单位进行研究,技术尚未完全成熟,工acid-related substances by microorganisms part I. Production of a.业上还未采用,但本研究组目前已取得比较好的进denosine by mutants derived from bacillus sp[J]. Amino Acid and展,相信不久就可用于工业生产中;采用化学合成生Nucleic Aeid, 1972 ,25 :106 ~ 112产腺苷的生产成本为35万~40万元/t左右,目前[8]邱玉棠,施庆珊,李崇,等.0Cor射线辐照选育肌苷高产菌株MI.-41的研究[]].核农学报，1995 ,9(3);175 ~179.仍是国内生产腺苷的主要方法,广东肇庆、山东明水[9] Akira T. Preparation of nuclesides by the hydrolysis of 5' -nucle-等地的药物就是采用肌苷为原料生产腺苷;RNA降tides (J]. Yakugaku Zssh,1965,85 (7) : 658 ~ 661解法曾经是生产腺苷的主要方法,以前福建莆田广[10]杨西宁,董春红,榮桂荣.腺苷的合成新工艺研究[J].精细化东湛江海口等地的工厂曾用此法生产腺苷,但因为工,2001, 18 (6) :317 ~318RNA产量有限，成本太高,目前基本不采用此法。[11]周涛、三氮唑核苷合成工艺的改进[J].中国药物化学杂志，1996, 27.(2) : 133-135.国内腺苷的年需要量为300t左右。腺苷本身是一种心血管药物,又是其它核苷类([12]周乐,史远刚,王建辰.6.氣-B-D.呋喃 核糖嘌呤的合成[J].化学通报,1996 ,5:31 ~32药物合成的前体,随着腺苷下游研发工作的深入,一([13]R.J苏哈道尼克著.核苷类抗菌索[M]_北京:科学出版社，些新的用途还在不断开发出来,如治疗恶性肿瘤药1982,1 ~153(上接第6页)要原材料对羟基苯乙酸的优势,又有工业化技术水4市场需求、前景预测及发展趋势平高的优势,所以该产品有很强的市场竞争力,目前目前皮肤病外用药品大部分都是甾体激素类药产品供不应求。现在正积极开拓国外市场,特别是品，副反应多,不宜长期使用;还有一部分销准字产西欧市场,相信该产品定会有好的发展前景。品,科技不成熟,疗效不确切,市场不稳定。目前该产品的市场参考价格在80万~90万丁苯羟酸主要用做非甾体抗炎药,以丁苯羟酸元/t,是个高附加值的产品,很值得研究和推广。0为原料药,制成丁苯羟酸乳膏(国家新药)已在湖南迪诺制药和海南三叶制药有限公司批准生产。该品具有消炎镇痛作用,外用可在局部组织达到较高浓[1] Xadhad Hoch. 1990,34(3). 212 ~214( Korea)度,而很少进入体循环。适用于湿疹和神经性皮炎、(2) Kokai Tokkyo Koho[P]. JP 81 118 004 ,1986接触性皮炎等皮肤炎症疾病。(3] Kokai Kokuy([P] JP 8062050 ,1980国内外市场都需求该产品,国内预计每年需求[4]徐燕.丁苯羟酸的合成[J].中国药物工业杂志(信息版) ,1995,8:20丁苯羟酸1t左右,随着该药品的推广, 需求量还会[S)李庆中国煤化工，广东药学院学报，上升,国外需求量较大。中昊宣化公司接到的订单1999MYHCNMHG中,意大利曾超过10t,日本曾超过4t,印度、韩国超[6]科技查新报告201500030丁0苯羟酸新产品新工艺研究过2t。随着中昊宣化开发该产品的成功,加上有主.[7]中华人民共和国卫生部标准(试行)WS-249(X-214)-96