MALDI-TOF生物质谱成像技术的进展

2010年第3期分析仪器综述MALDⅠ-TOF生物质谱成像技术的进展杨帆原剑郑俊杰魏开华(1.军事医学科学院放射医学研究所,北京,100850;2.北京蛋白质组研究中心,蛋白质组学国家重点实验室,北京,102206摘要随着 MALDI-TOF等生物质谱仪器性能的提升和应用领域的扩大,基于MALD的质谱成像技术已成为研究肿瘤标志物、药物代谢、脂类分布等方面的有力手段。最新样品前处理方法以及自动化基质喷涂等技术的发展大大提高了质谱成像技术的灵敏度和分辨率。利用原位酶切技术直接鉴定组织切片上的蛋白质和多肽是IMS当前的热点和关键。体内药物代谢物分布、脂类物质分布以及植物组织的质谱成像等研究逐渐成为新的应用热点。本文较系统地介绍了生物组织质谱成像技术的研究进展。关键词质谱成像基质喷雾器原位酶切福尔马林三维重建1引言片和结合磁共振临床诊断等领域有了新的应用。本文对质谱成像技术的当前热点和最新进展进基于MALD-TOF生物质谱的组织成像技术行了综述(MALDI- imaging mass spectrometry, MALDIIMs)是一门新兴的分子成像技术,对于发现疾病生2基质喷涂设备物标志物和研究药物代谢等方面具有重要意义,并提高基质喷涂技术的重复性,获得分布均匀和具有良好的临床应用前景。MALD-MS近期的大小合适的基质结晶颗粒是提高质谱图像灵敏度和发展主要在改善灵敏度提高分辨率、扩大应用范围分辨率的重要手段,是MALD-Ms样品处理中最以及标志物的鉴定等方面。灵敏度和分辨率主重要的环节,也是近年来各国研究者和质谱仪器厂要受激光器频率和能量样本切片质量基质喷涂效商研究的热点。目前,基质喷涂的方式包括手动气果等因素影响。高频率(200Hz和1000Hz)的固体喷雾、压电高频振动喷雾、声控微滴喷射和化学打印激光器已经普遍用于 MALDI质谱中,可在较短时机喷射等。间内完成一个切片的成像质谱数据采集但可调光2.1手动式气喷雾器束直径的激光器对于IMS更有利。切片质量和基手动式气喷雾器是最早用于基质喷涂的工具质覆盖一直是IMS的一个技术瓶颈。近年来,一些其原理与常用的喷雾器相似,利用气压将基质液滴研究者和质谱公司开发了新型基质喷涂设备和技喷在组织切片上,基质能以气溶胶大小的液滴覆盖术改善了切片前处理方法,大大提高了质谱成像技在组织切片上。该方法简便易行,但人工操作经常术的灵敏度和分辨率会导致每次喷雾的均匀度、厚度不一致,多次喷雾也MALDI-IMS起初用于研究组织中的蛋白质和容易导致重结晶位置发生变化。近年我们探索了新多肽分布,近年来研究对象涵盖到了脂类、小分子药型的质谱成像基质喷雾器,其特征在于物等,它在生物标志物发现、组织结构研究和药物代(1)喷雾调节室带有一个可调节气流的入口和谢等领域具有重要前景。随着原位酶切技术、三维重一个外延形的毛细管喷嘴。毛细管喷嘴为外延形双构技术的成熟质谱成像技术在福尔马林固定组织切重套V凵中国煤化工溶液NMHG作者简介:杨帆,男,25岁,在读硕士研究生,药物分析学专业,方向为生物质谱应用,Emal@gmail.com通讯作者:魏开华男博士,研究员,E-mail:bprc999@gmail.com分析仪器2010年第3期(2)容器带有一个可调节气流的入口。本装置在组织切片表面形成结晶颗粒。该系统具有全自动具有气量调节灵活、喷雾好雾滴细、基质覆盖薄而基质厚度传感和控制系统能适合更广泛的生物组且均匀、重复性好、节约基质材料等特点,可满足质织质谱成像研究。谱成像的高准确性、高重复性和高灵敏度要求已获与手动气喷雾法相比,自由沉降有以下优点:得专利(专利号2008200797131)。(1)该方法是通过可调的高频率振动产生雾滴2.2压电高频振动基质喷雾器雾滴的大小均匀,有利于在组织切片表面形成均匀压电高频振动基质喷雾器 Imageprep( Bruker的共结晶颗粒,提高检测灵敏度。(2)喷出的雾滴是Daltonics)是一款商品化的基质喷雾设备。它的原在重力作用下自由沉降于组织表面,相同大小的雾理主要是利用喷出的雾滴以自由沉降的方式在组织滴沉降速度相同,因而在组织切片表面形成一定层切片表面形成结晶,如图1所示。基质装在倒置的次的基质颗粒提高基质的覆盖率。(3)整个基质喷雾过程是全自动控制,可调节喷涂时间以控制合适压电陶瓷的共结晶颗粒覆盖层的厚度,具有较高的重现性(4)喷雾是在一个密闭的充满氮气的环境中进行,防基质溶液止了氧气的氧化作用和气流干扰,使沉降更加稳定雾滴自由沉降本实验室应用该装置对大鼠肝组织切片喷涂基质,质谱样品靶的无切片区域,基质结晶颗粒分布均带小孔的薄片匀厚度适宜(图2C)。而在大鼠肝脏组织切片区域图1压电高频搌动基质喷涂器原理图能很清晰的看到肝脏组织的网状结构特征(图2A)瓶子中,瓶口与一带小孔的垂直薄片相接触,薄片上直接从放大的光学图像上就可以观察到组织的结构方与压电陶瓷相连。喷雾时,通过电压的变化调节特征这说明该喷雾法具有良好的组织分辨率。另薄片振动的频率和振幅基质溶液水平喷出,喷出的外,该方法在高分子量端的质谱信号明显优于其它雾滴在重力作用下自由沉降在水平放置的靶上,并喷雾法说明该方法在高分子量端的灵敏度有改善图2基质喷涂效果A.覆盖基质的大鼠肝脏切片B切片照片C覆盖基质的靶上无切片区城2.3声控微滴喷射器储液器中装满基质溶液,利用超声波发射器的声控微滴喷射器( acoustic reagent multispotter,声波能量使液体表面变形(图4A),拉伸成锥形结构ARM利用声波的能量将基质液滴喷射在组织表(图4B)。当射频电压幅度足以造成锥形结构决裂面,声控微滴喷射器结构见图3喷射过程见图4。成一个球形液滴时(图4C),声波能量即达到阈能平行移动台值。这时轻微增加射频电压的幅度使液滴自下而上地垂直喷射至组织表面(图4D)该方法不含毛细管和喷嘴,避免戳破组织表面储液器水柱摄像头中国煤化工射的液滴(180200超声波发射器精确CNMHG或以矩阵方式覆图3声控微滴喷射器结构示意图盖整个组织表面。以不同的喷射频率连续喷射储存2010年第3期分析仪器基质不但可有效地提取组织中的蛋白,而且蛋白移的优点是能精确控制基质液滴在组织切片上的分布位程度也大大降低。雾滴的尺寸可以改变位置,大大减低了基质喷涂过程中所带来的随机误差和成分在基质溶液中的移位。而手动气喷雾法和压电高频振动基质喷雾法产生的基质共结晶更小,能达到更好的分辨率。衰1四种基质喷雾方法的特点比较喷射模式液滴大小(pm)分辨率移位现象重复性高频振动喷雾20~50高新型手动气喷雾20~50化学打印喷射120~500中有有无无声控微滴喷射100~200中图4基质液滴喷射的过程切片预处理A.超声波使基质溶液液面变形为了提高 MALDI-IMS的检测灵敏度,减少B.提高超声波能量使锥形液柱上方形成液滴组织中盐类等对质谱信号的干扰十分关键,对切片C.能量达到阈值D.液滴向靶上喷射进行短时间的浸泡和冲洗是简便而有效的方2.4化学打印喷射器法9-1。乙醇能去除组织切片中的脂类,而不影响化学打印喷射器( chemical inkjet printing)是一切片上蛋白质的信号,可用于切片的长期保存1款商品化的微滴基质覆盖装置。它的原理与喷墨打氯仿,正已烷甲苯,丙酮,二甲苯也可用于清洗组织印机类似向待喷基质的组织表面按一定的矩阵点逐切片,能够去除脂类提高蛋白质的质谱信号点喷涂上基质(图5)。该仪器可根据选定区域选择 Seeley E H等“将干燥后的切片分别浸泡在不同分辨率不同的基质喷涂点分布,对每个喷涂点的位置的混合溶液中轻微振摇30s,再采用相同的流程采精确控制。同时该设备还可用于原位酶切膜上分析集质谱成像数据比较各种清洗方法处理后的质谱等技术中。 Soya a.Patl等应用化学打印机结合出峰情况(图6)。通过比较不同溶剂处理后蛋白质质谱成像技术研究了人口腔上皮细胞癌的差异蛋白和脂类的总离子流强度(TC),发现溶剂处理后,平质组,获得了重现性良好的质谱图像。均质谱图基本一致,一些有机溶剂清洗组织切片后脂类和蛋白质类的质谱图有明显改善。如图7所示,经同一种溶剂清洗处理后,蛋白质TIC越高,脂6中a心dee类TIC就越低原因可能是两者竞争离子化或者是清洗去除了细胞膜结构使更多细胞内蛋白被检测姿心昏●彰动到。因此,甲醇、醋酸水溶液和异丙醇清洗组织切片后可提高蛋白质质谱信号的强度,而对于脂类的分心ee析用氯仿和丙酮清洗更合适图5化学打印机喷射基质溶液后的组织表面4质谱成像分析软件以上四种喷雾方式的特点如表1所示。声控微中国煤化工转化为质谱图像,滴喷射器和化学打印喷射器能将基质溶液以较小的以及液滴覆盖在组织切片上液滴通常为100pl左右,产术中CNMHG,也是质谱成像技。不,各质谱仪器厂商生的共结晶点大小直径为150μm左右。这类方法争相开发了适合本公司仪器的质谱成像配套软件。分析仪器2010年第3期丙酮氯仿乙醇TTTM混酸甲酯甲苯Ln二甲苯500015000质荷比(m/2图6不同溶剂清洗或不清洗小鼠组织切片后获得的 MALDI-TOF平均质谱图蛋白质(10)+图7小鼠组织切片的MALD】-TOF平均质谱图的TIC比较z500~1100(脂类)m/z200~25000(蛋白质)Fleximaging系列软件(布鲁克公司)已能方便ptol地控制图像采集和数据处理,结合该公司的biotools软件,能应用质谱成像数据进行生物标志物的发掘。本实验室的大部分数据均是在这套系统4000中完成采集和分析的Biomap(http://www.mald i-msi.org/)软件起初用于磁共振数据成像。如今,已不断升级成为可以对 optical,PET,CT,NIRF和MSI等数据进行成像分析的综合性软件。本实验室用标准多肽在MALD-TOF/TOF(AB4700)的金属靶上涂成一定分布后,应用 bitmap分析采集的质谱数据(图8),获得标准肽段m/zl046的分布(图9),并比较了两个区域离子强度的强弱,以此比较信号之间的差别。该软件可以方便地对各类MALDⅠ-TOF质谱数据进行二维成像,比较选定区域某成分的差异并进行统计分析,但是该软件目前中国煤化工3500能处理的数据量较少,图像分辨率低,难以应用到精CNMHG细组织结构的质谱成像研究。图8采集区域的质谱图2010年第3期分析仪器a::Roi sine 0 0000oo mm'2mZ104647图9 Bitmap软件分析质谱成像数据A.m/z1046的分布区域1Bm/z1046的分布区域25新技术及其应用这样就避免了重建过程所造成的伪像痕迹,缩短了在体数据中寻找、计算物体表面的时间。这种方法5.1三维重建技术不丢失细节,能更加准确地反映出体数据所包含的三维重建技术(3- D reconstruction)是通过二形状结构。维断层图像来构建三维模型并进行显示的一项数据5.2质谱成像技术在诊断学上的应处理技术。在组织切片上进行的质谱采集通常得到医学影像技术已经成为临床诊断的必备手段,的是二维空间质谱图,将一系列连续切片的二维图但是绝大部分不能在分子水平上提供组织成分的分像通过三维重建后得到是各个成分(m/z)的三维分布信息,而质谱成像技术能在分子水平上发现病变布信息。组织的标志物,因此在临床诊断上具有较好的应用目前,研究者正着力解决如何提高重建图像的前景。 Elena等比较了用质谱成像技术和核磁共准确性。Mlin1获得了鼠脑组织中物质P(m/z振分析组织成分分布的效果,研究表明质谱成像可1347.8[M+H]+)和PEP19(m/z6717[M十用于组织体内药物分布等方面的考察。 Thiery GH+)的三维重建图。先对连续切片进行比对、校等应用免疫技术结合质谱成像获得了转移性黑准,每个平面上的四个点与相邻切片上的四个点构素瘤的标志蛋白在胰腺中的特征分布。 Tuhin成一个数据体;以其峰强度作为每个点的体数据,以等获得了同一组织的三维质谱图像和磁共振图整个数据中的最大强度值为基准将所有强度数据像。该方法以神经胶质瘤疾病为模型,以小鼠脑组256等分,根据体数据的值对每一数据点f(x,y,z)织为分析对象,采用MALDⅠ-IMS技术获得了神经赋予颜色值(R,G,B),以强度最大值的体数据点胶质瘤标志物的空间分布情况。对该疾病模型的两(256,256,256)为白色。再根据各数据点所处的梯个标志物—星型磷酸化蛋白(Pea15,m/z15035)度及光照模型计算出各数据点的光照强度,对获得和脂肪酸结合蛋白5(Fabp5,m/z15076)的空间分的数据平滑处理;再将数据体逐一投射到三维坐标布做了三维重建。然后对肿瘤模型小鼠的两个标志系中,形成三维图像;然后将投射到图像平面中同一物分布区域做MRI检测分析,比较正常组织与病变象素点的各数据的半透明彩色值综合在一起,最后组织之厂中国煤化工T1、T2三个参形成图像,这种方法称为基于体数据法( Volume数的差CNMHGALDI-1MS和Rendering)。其三维重建技术的最大特点是不需要MRI的分贯宄衣明 MALDI-IMS检测指确立表面的几何表示,而直接基于体数据进行显示,标差异(两种标志物的信号强度, Intensity)与MRI分析仪器2010年第3期检测指标差异相似。但MALD-Ms技术检测差是原位酶切技术的难点。另外,组织切片上的有些异更明显。蛋白质结构复杂需要变性或还原才能被有效酶切成肽段,如何进行原位酶切前的预处理也是一个影响酶切效果的关键问题原位酶切技术也可被用于分析福尔马林固定的组织切片研究。 Lemaire等2比较了新鲜鼠脑组织切片在常规冷冻干燥法制片和福尔马林固定石蜡包埋切片两种处理方法下的质谱成像效果,结果发现正常m肿瘤福尔马林固定石蜡包埋切片由于其蛋白质交联严重,信号较低。通过原位酶切技术处理组织切片后,信号明显提高。因此,开展福尔马林固定组织的质谱成像分析是可行的,具有良好的临床应用前景。54质谱成像技术在研究小分子和脂类分布中的应用图10正常组织与病变组织IMR与IMS检测结果对比质谱成像的应用领域已不仅局限于蛋白质多A.磁共振成像结果与质谱成像结果;肽的分析。小分子、脂类的分布对于生物组织体的B磁共振和质谱成像参数在病变部位与正常部位的比较发育和神经系统具有重要意义。体内的药物代谢分■正常口肿瘤布21、脂类分布以及植物组织的质谱成像研究逐渐53原位酶切( (in situ tryptic digestion)技术及其成为应用的热点, Geta H等应用基于纳米微粒在福尔马林固定组织切片中的应用辅助激光解吸离子化( nanoparticle-assisted laserMALD-IMS直接获得不同分子量的物质在 desorption/ ionization)质谱成像技术,获得了脂类组织切片上的分布信息,对于分子量较大的蛋白,难物质在海马不同部位的分布特征。Yuk等2运用以直接通过串联质谱(MS/MS)分析鉴定。原位酶质谱成像技术研究了大鼠脑中的一种有细胞选择性切技术是将酶液微滴点在组织切片上,在适当的温的甘油磷酸脂的分布,这为研究其功能打下了良好度和和时间内将蛋白质在其原有位置上酶切成若的基础。 Kristin e. Burnum等3运用质谱成像技干肽段的一项新技术,该技术可通过对酶切后肽段术研究了小鼠胚胎移植部位在发育过程中磷脂的分的MSMS分析,鉴定其所属蛋白质。Red布变化。 Zheng等“通过模拟体外过程首次通过Groseclose等20运用化学打印机(ChP-100, Shi- Label- free IMS研究了生物膜系统的脂类之间的mazu Co.)将浓度约为0.1g/pL,pH约为8的胰作用。酶液滴喷涂在组织切片表面,体积为15nL,直径200ym的小液滴自然干燥后将组织切片置于常温6展望下(21℃)4h,最终获得了鼠脑组织酶切后的多肽分随着 MALDI-TOF等生物质谱性能的提高,布。通过对组织切片上的多肽进行MSMS分析后基质喷涂新技术的出现和样品处理方法的改进,质发现鉴定到相同蛋白质的多肽其分布特征一致,且谱成像技术的分辨率和灵敏度正逐步提高。但是不与该蛋白质直接成像分析的结果一致,表明蛋白质同公司的喷涂技术、不同质谱仪器和操作软件的差在酶切过程中位置未发生变化原位酶切技术提供别,使得质谱成像结果之间的可比较性不高。虽然了蛋白质的鉴定成功率。尽管原位酶切技术为直接 BioMap可以读取多家公司的质谱数据但它能处鉴定组织切片上的蛋白质提供了新的方法,但目前理的数据集不高影响了质谱成像的分辨率。另外,该方法的条件仍有待优化。胰酶的量过高,其自切它中国煤化工谱化内容。建立高肽段将影响低丰度蛋白质的检测,而胰酶的量过低,自标准化操作流程,同一位置的一些蛋白质可能不能被酶切,因此,在蛋对CNMH意义白浓度不均匀的组织切片上如何覆盖合适浓度的酶目前,动物组织样本是研究的热点,对植物组织2010年第3期分析仪器样本的研究鲜有报道。随着质谱成像技术的日益发2006(78):827-834展,相信植物组织样本是以后研究的趋势。但由于8 Barnes A,eta. The analyst,2009,134(2):301-307植物组织的特殊性,寻找更好的基质和相应的喷涂9许彬,魏开华等军事医学科学院院刊20630(3):288方法将成为该项研究的热点和难点。 Zhang H291等(运用胶体石墨作为基质,对水果中的小分子进10许彬,魏开华等.科学仪器与装置,2008,1011刘念,刘锋等.分析化学,2008,36(4):421-425行了质谱成像分析,初步建立了一种植物组织质谱12 Schwartz S A, Reyzer M L, Caprioli R M. J Mass成像的新方法。红外激光源的应用也有利于植物中小分子的检测。LiY等(0运用大气压红外激光源13 Lemaire R, Wisztorski m, Demons a, Tabet JC,DyMALDI-MS(AP IR-MALDI mass spectrometry)R, Salzet M, Fournier l. Anal Chem, 2006, 78:7145对植物各个部位的小分子化合物进行质谱成像研7153究,通过串联质谱分析鉴定到了50种以上小分子代14 Seeley E h, Oppenheimer S R,MD, Chaurand P,谢物和脂类物质Caprioli R M. J Am Soc Mass Spectrom, 2008, 19(8):对组织中蛋白质和多肽直接鉴定,一直是研究1069-1077质谱成像技术的难点问题。原位酶切技术可以提高15 Norris J L, et al. Int J Mass Spectrom, 2007, 260, 212鉴定的成功率。随着该技术的日趋成熟,鉴定组织16 Andersson M, Groseclose M R, Deutch A Y. Nature中特异性分布的蛋白质和多肽,以及其功能验证,也Methods,2008,5:101-108将是质谱成像技术的一个重要发展方向。17 Acquadro E, et al. Anal Chem, 2009, 81: 2779-2784质谱成像技术与较为成熟的磁共振诊断技术的18 Thiery G, Shchepinoy m s, Southerne m, Audebourg临床诊断比较研究,使得质谱成像技术的临床应用A, Audard V, Terris B, Gut IG. Rapid Commun Mass前景更加明确,已经受到国际上科研工作者和质谱Spectrom,2007,2l(6):823-829仪器厂商的重视,预期临床诊断将是未来质谱成像19 Sinha K, et al. Nature Methods.,2008,5:57-59应用研究的主要方向之一。20 Groseclose M R, Andersson M, et al. J. Mass Spectrom,2007,42:254-262参考文献21 Lemaire R, Desmons A, Tabet J C, Day r, Salzet M,1 Caprioli R M, Farmer T B, Gile J. Anal Chem, 1997Fournier L. J Proteome Res, 2007, 6(4): 1295-130569(23):4751-476022 Sugiura Y, Setou M. J Neuroimmune Pharmacol.(pub2 Cornett D S, Reyzer M L, Chaurand P, Caprioli R M.lished online), 2010.5(1):31-4323 Hiroshi, et al. Med Mol Morphol, 2009, 42: 16-23Nature Methods,2007,4(7):828-8333 Atkinson S, Loadman P M, Sutton C, Patterson L H4 Sugiura Y, et al. J Lipid Res(published online), 200950(9):1776-1788Clench MR. Rapid Commun Mass Spectrom, 2007(21)1271-127625 Burnum K E J. 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Bijing Proteomics Research Center, State Key laboratorHCNMHG102206)With the improvement of the performance of matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight分析仪器2010年第3期mass spectrometry (MALDI-TOFMS)and the expansion of its application fields, the imaging mass spec-trometry (IMS)based on MALDI-TOF has become a powerful tool for studying tumor markers, drug me-tabolism, lipid distribution and so on. The latest sample pre-treatment methods and auto matrix-coatingtechnologies have greatly increased the sensitivity and resolution of IMS. Direct identification of proteinsand peptides on tissues by in-situ enzyme digestion is an important focus and key point of IMS. Distribu-tion of drug metabolites and lipid, and IMS for plant tissues are the new fields of applications. This paperreviews systematically the advances of the research and applications of IMS欢迎订阅《分析仪器》《分析仪器》创刊于1970年由中国仪器仪表行业协会、北京分析仪器研究所主办国内外公开发行,双月刊(刊号6-90,列在邮局报刊目录天津地区),是分析仪器领域历史最悠久的科技期刊本刊主要反映分析仪器和仪器分析技术的发展动态;报导分析仪器科研成果新型仪器和仪器的改进;探讨分析仪器和仪器分析的有关理论;推广分析仪器的应用技术;交流分析仪器使用和维修经验;介绍分析仪器和仪器分析方法的基础知识等。主要栏目有:综述仪器研制与改进仪器应用、讨论与研究、知识介绍、仪器使用与维修、实验室管理等。主要读者对象是科研单位、石油、化工、冶金、地质、食品轻工、农业、医药卫生环境保护仪器制造等部门的科技人员,高等和中等专业学校有关专业的教师与学生《分析仪器》是《中国科技论文统计与分析》(年度分析报告选用刊物,中国核心期刊,并被美国《化学文摘》及国内多种数据库收录。已人编《一数字化期刊群》《中国学术期刊(光盘版)》、《中国学术期刊综合评价数据库》、《中国核心期刊数据库》。欢迎订阅,欢迎投稿编辑部地址:北京市海淀区温泉北京分析仪器研究所邮编:100095电话/传真:(010)62403151E-mail:fxyqzzi@126.com网址:www.bjfxys.com中国煤化工CNMHG