酶的活性及其与凹空细胞分型的关系

中华医学杂志2002年2月25日第82卷第4期 Natl Med J China, February25,2002,Vol82,No.4论著宫颈癌及宫颈上皮內瘤样病变组织中端粒酶的活性及其与凹空细胞分型的关系冷冰卞美璐孙霭萍范慕贞陈庆云【摘要】目的研究宫颈上皮内瘤样病变(CⅣN)宫颈癌的组织和脱落细胞中端粒酶的活性变化探索端粒酶激活与凹空细胞分型及人乳头状瘤病毒HV感染之间的关系。方法采用端粒酶重复扩增技TAP)检测24例正常宫颈、34例宫颈炎症、78例CIN及16例宫颈癌的宫颈组织和脱落细胞中端粒酶的活性。同时采用双盲法检测上述宫颈病变组织中凹空细胞的分布并将其分为Ⅰ型和Ⅱ型。结果组织中端粒酶阳性率分别为正常宫颈组织为16.7%(4/24)炎症组织为17.6%(6/34)CIN组织为51.6%(16/31)CN2组织为72.0%18/25)CIN3组织为86.4%(1922)宫颈癌组织为100%(1616)端粒酶阳性率CN明显高于正常宫颈及炎症组织卩<0.01)宫颈癌组织明显高于CIN组织P<0.05)xN3高于CN(P<0.05)而正常宫颈与炎症组织比CN1与CIN2比CN2与CN3比较差异均无显著意义P>0.05)相应的宫颈脱落细胞中端粒酶阳性率同组织标本比差异无显著意义(P>0.05)含Ⅰ型、Ⅱ型凹空细胞的宫颈病变组织中端粒酶阳性率分别为66.7%和100%两者差异有显著意义P<0.01)结论(1)端粒酶的激活与宫颈癌及CIN的发展有密切关系端粒酶可作为宫颈癌及ⅣN的标志物。(2)宫颈脱落细胞可以替代组织标本进行端粒酶活性检测。(3端粒酶的激活与Ⅱ型凹空细胞的出现及HPV6/18感染有密切关系。【关键词】宫颈上皮内瘤样病变;宫颈肿瘤;端粒末端转移酶;乳头状瘤病毒人Telomerase activity in cervical carcinoma and cervical intraepithelial neoplasia and its correlation toclassification of koilocytosis LENG Bing, BIAN Meilu, SUN Aiping, FAN Muzhen, CHEN QingyunDepartment of Obstetrics and Gynecology, China-Japan Friendship Hospital Beying 100029, Chin(Abstract] Objective To investigate the telomerase activity in cervical tissues and exfoliated cells inpatients with cervical intraepithelial neoplasia CIN )and cervical carcinoma, and to study the correlation betweentelomerase activativity and koilocytotisis classification and between telomerase activity and human papillomavirus(HPV ) infection. Methods Telomeric repeat amplification protocol TRAP bvas used to determine the telomeraseactivity in cervical tissues and exfoliated cells in 24 women with normal cervix 34 patients with cervitis 78 patientswith CIN and 16 patients with cervical carcinoma. The patients with CIN were classified into 3 subgroups accordingto the abnormality of cervical cells( 31 CIN, cases 25 CIN, cases and 22 CIN3 cases ) The presence andclassification of koilocyte in cervical tissues was examined by microscopy with double blind method. The telomeraseactivity in koilocytes of different types was investigated. Results The telomerase positive rate was 16.7%(4/24in normal cervical tissue 17 6%(6/34 )in cervitis tissue .1.6%(16/31)in CIN, tissue 72.0%( 18/25 )inCIN2 tissue 86.4%( 19/22 )in CIN, tissue, and 100%(16/16)in cervical carcinoma tissue respectively.Thetelomerase positive rate in Cin cases was significantly higher than those in normal cervix and cervitis case( all P<0.01 )and the telomerase positive rate was significantly higher in cervical carcinoma than in CIN P<0.01 ). Itwas also significantly higher in CIN3 than in CIN, P< 0.05 ), while no significant difference was found in thetelomerase positive rate between normal cervix and cervitis, CIN, and CIN2 and CIN2 and CIN,( P>0.05). Nesignificant difference of telomerase positive rate was found between the cervical tissue and exfoliated cells in thesame case tod P>0.05 ) Koilocytes were found in sixty-four out of the 154 samples of cervical lesions. Amongthem koilocytes were found in 54 out of 94 samples of cervicaland CIN tissues( koilocytes of type I in 18cases and type II in 36 cases ) The telomerase positive rate was 100% in tissues of CIN and cervical carcinomawith type I koilocytosis significantly higher than that in tissues with type I koilocytosis( 66.7%, P<0.05)telomerase is closely associated with progression of CIN and cervical carcinoma andtelomerase might be a useful marker for cervical carcinoma and CIN. (2 Cervical exfoliated cells may be used as中华医学杂志002年2月25日第82卷第4期 Natl Med J China, February25,2002,Vol82,No.4263the substitute of cervical tissues in determining telomerase activity. 3 )Activation of telomerase is correlated withtype I koilocytosis and HPV 16/18 infection[ Key words Cervical intraepithelial neoplasia Cervix neoplasms; Telomerase: Papillomavirus近年来大量研究表明肿瘤组织中端粒酶活性冻后研磨将粉末转至试管中加入预冷的清洗液达67%-100%12。人乳头状瘤病毒HPV撼染与800l[10mmo/LpH8.0 EPES-KOH,1.5mmol/L宫颈上皮内瘤变和宫颈癌的发生、发展密切相关。MgCl,0mmol/ L 1 mmol/L二硫苏糖釀DT)],那么在宫颈癌变过程中端粒酶的激活与HPV感染充分混匀冰浴5minA℃、2000r/min离心5min有何关系?我们通过比较含Ⅰ型、Ⅱ型凹空细胞的弃上清加入预冷的裂解液200μ[10mmol/LpH7.5宫颈癌及宫颈上皮内瘤样病变CN织中端粒酶iHC4 mmol/L mocl2,1mmo/乙二醇双B乙的活性变化探讨端粒酶激活与凹空细胞分型及胺醚)四乙酸5moJ/L二巯基乙醇,.5% CHAPS,HPV感染之间的关系。10%甘油]冰浴30min期间震荡摇匀数次A℃、1对象与方法500r/min离心30min将上清分装于预冷的试管中其中的一管用Ioww法行蛋白测定其余数管冻存对象于-70℃冰箱。(2涫颈脱落细胞端粒酶的提取在1.宫颈组织标本:199年4月~2001年4月,试管内加入1mlPB无RNA酶)将新采集的宫颈在中日友好医院妇产科门诊行计算机辅助细胞检测拭子放入试管内冲刷几下2000r/min离心5min,( computer-assisted cytologic technique, CCT)结果异常弃上清沉淀中加入预冷的清洗液80oμd涂咸1的患者在阴道镜下取活检组织共128例将一部(3)宫颈鳞癌细胞系HLa)細胞端粒酶的提取作分组织送病理检查另一部分冻存于-70℃冰箱备为阳性对照):用0.5%的胰酶消化培养的Hela细用。经病理学检查证实,其中急、慢性炎症34例,胞用RPM-1640细胞培养液将Hela细胞冲洗下来例根据细胞异常程度将CIN分为3级其中并转移至试管中2000r/min离心5min弃培养液131例CN25例CIN322例包括原位癌3例),加入1mlPB(无RNA酶重悬细胞再次离心弃上浸润癌16例。另取24例经病理学检査证实为正常清加入预冷的清洗液800μ余同(1的宫颈组织作为对照。2.RT-PCR扩增端粒DNA将含5{g蛋白的提2.宫颈脱落细胞标本:所有取组织标本的患取液加到20dPCR液中20 mmol/L pH8.3Ti者均在手术前取其宫颈拭子。方法将无菌棉拭子HC,1.5mmol/ L MgCl2,63mmo/LKCl,1mmol/L绕宫颈鳞柱交界处擦拭2周。FGTA0.005% Tween-2050mol/L4种脱氧核苷三二、Ⅰ型、Ⅱ型凹空细胞的检测磷酸dNTP),1ggT4基因32蛋白A0.2 pg TS引物对活检组织标本进行凹空细胞的检测和分型,(5′ AATCCGTCGAGCAGAGTT3')]混匀20℃保温30端粒酶检测和凹空细胞分型采用双盲法进行。根据min90℃放置3min加入5Utaq酶、0.21CX引物文執3]将凹空细胞按核表现分为两类:Ⅰ型凹空(5′ CCCTTACCCTTACCCTTACCCTTAA3′)覆盖2滴石细胞和Ⅱ型凹空细胞。Ⅰ型凹空细胞的特点为:核蜡油混匀,进行PCR循环。循环参数:94℃45s增大但不超过底层细胞核的1倍核形不规则染50℃45s,72℃60s共35个循环结束后72℃延伸色深结构不清可见双核馮见病理性核分裂相即mi。试剂盒购自北京鼎国生物技术发展中心。以放大400倍为高倍视野病理性核分裂相1~2个3.PCR产物的聚丙烯酰胺(PACE澱凝胶电泳和/5个高倍视野。Ⅱ型凹空细胞特点为核为底层细银染取15μlPR产物加入1dl上样缓冲液混匀胞核的2~3倍,可见双核、多核、畸形核或巨核有后在0.5×Tris硼酸-EDA电泳缓冲液TBE)用的核结构清晰,可见核仁,有的染色质浓聚呈团块12%PAGE、400V电压电泳1h,然后取下凝胶银状结构不清核膜增厚不连续核浆比例失调常染。当在50b处岀现第1个条带,并有多个递增见病理性核分裂相1~6个/5个高倍视野。的间隔为6bp的条带出现时端粒酶为阳性。TRAP法检测端粒酶活性四、统计学处理中华医学杂志2002年2月25日第82卷第4期 Natl Med J China, February25,2002,Vol82,No.4正常宫颈、宫颈灸症、CIN1、CIN、CIN3及宫颈癌结果患者的宫颈脱落细胞端粒酶阳性率分别为:16.7%宫颈癌及CN组织中端粒酶活性的变化(4/24)17.6%(6/34)54.8%(17/31)76%(19/经病理证实的正常宫颈、宫颈炎症、CIN1、CIN2、25)86.4%(1922)及93.7%(15/16),与相应组织CⅠN3及宫颈癌组织标本共152例其端粒酶阳性率标本中端粒酶的阳性率比较差异均无显著意义校分别为167%(4/24)17.6%(6/34)51.6%(16/正x2或x2分别为0、0、0.0650.104、0,P>0.0531)72%(18/25)86.4%(19/22)及100%(16/16)见表1图2其中CⅣN共78例53例端粒酶呈阳性,占67.9%CN端粒酶检出率高于正常对照组和炎症组x2=34.40,P<0.01)浸润癌端粒酶检出率高于CN组(校正x2=544,P<0.05)CN同CN比较x2=8.40P<0.05洏而炎症组同正常对照组相比,CIN同CN2比CN2同CN比差异均无显著意义校正x2或x2分别为02.002.41,P均>0.05)见表1图1。1. Markert(PBR322DNA/HaeⅢ);2.端粒酶裂解液阴性对照3.正常宫颈拭子A5.CIN的宫颈拭子为7.CIN2的宫颈拭子表1宫颈癌及宫颈上皮内瘤样病变组织与脱落8、9.CIN3的宫颈拭子0、11.宫颈癌的宫颈拭子;2.Hela细胞细胞中端粒酶检出情况裂解液阳性对照组织标本脱落细胞图2宫颈脱落细胞中端粒酶活性的检澉TRA法,PR产物组别总例数端粒酶例数%)用性例数率%)的聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染结果)正常对照2416.716.7炎症17.6宫颈癌及CIN组织中端粒酶活性与凹空细胞分型的关系3151.6152例宫颈组织标本中64例有凹空细胞其中72.094例宫颈癌和CN组织中54例检出凹空细胞,I型浸润癌15凹空细胞18例,Ⅱ型凹空细胞36例端粒酶阳性率注与相应组织标本比较'x2或校正x2=0-2.41,P>0.05xN分别为66.7%(12/18厢100%(3636)两者比较差与正常组及父症组比较x2=3.4,<00漫润癌与CN组比异有显著意义校正x2=10.34,P<0.01)见表2,较个校正x2=54,P<001与CIN组比较=840,P<0.05:图3ACIN1、CN2及CN3分别为宫颈上皮内瘤样病变1、2及3级1011121314表2宫颈病变组织中I、Ⅱ型凹空细胞分布及其端粒酶的阳性情况I型凹空细胞型凹空细胞组别总例数例数阳性例数例数端粒酶日性例数正常组织40炎症CINy04750CIN012121. Markey(PBR322DNA/Hae)2.端粒酶裂解液阴性对照;3.宫颈癌正常宫颈斗.宫颈炎;、6.CN标本门78.CN2标本;-11注CIN、CIN、CIN3分别为宫颈上皮内瘤样变1、2及3级CN3标本(10、11为原位癌)12、13.宫颈癌标本4.Hela细胞提取液阳性对照图1宫颈癌及宫颈上皮内瘤样病变组织中活性的检测讨论假RA法PR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染结果)宫颈癌及CIN中端粒酶检出率的变化中华医学杂志002年2月25日第82卷第4期 Natl Med J China, February25,2002,Vol82,No.4立一种快速、有效的端粒酶测定方法。但就宫颈脱落细胞是否能代替组织标本进行端粒酶检测研究人员有不同的观点。 Wisman等131将宫颈拭子检测同组织检测相比指出用宫颈拭子检测端粒酶活性敏感度低不适用于宫颈癌筛查。有一些研究人员、、5认为用宫颈拭子检测端粒酶的活性是可行的1451我们的结果也表明宫颈脱落细胞可以替代组织标本进行端粒酶活性检测。宫颈癌及CN组织中端粒酶活性同凹空细胞分型及HPV感染的关系HPV感染特别是高危型病毒HPV6/18)的感染在宫颈癌前病变及宫颈癌发病中的重要作用已基本得到了公认68那么端粒酶的活性同HPV感染是否有一定的关系呢? Kawai等1探讨了宫颈癌组织中端粒酶的活化同HPV感染的关系结果表明端粒酶激活同宫颈病变中HPV感染关系密切。我们可以设想激活端粒酶可能是高危型HPV致宫颈癌的一个途径。然而仍有不同的观点, Yashima图3A凹空细胞的形态。图3为I型凹空细胞HE等认为宫颈病变中端粒酶的活性同HPV的感400图4为Ⅱ型凹空细胞HE×400染无明显的关系;Wimn等13的研究表明宫颈冰冻组织中端粒酶的活性与特异的HPV类型无关。度为5-15k其主要功能包括保护染色体的由于大家的看法并不一致这个方面的研究仍是当末端防止染色体复制时末端丢失决定细胞的寿前的热点命56。近几年大量文献报道在绝大部分恶性肿在我们以前的研究中3根据凹空细胞的核异瘤和无限增殖的细胞系中可检测到端粒酶的活性。型程度将其分为Ⅰ型和Ⅱ型。PCR法对照研究结这揭示端粒酶可能是一个广泛的肿瘤标志物在恶果表明含Ⅱ型凹空细胞的HPV感染APV1618占性肿瘤的发生、发展中起着重要的作用78。我们86.0%含I型凹空细胞的HPV感染HPV16/18占比较了正常宫颈、宫颈炎症、CIN宫颈癌组织中端粒16.7%HPV6/11占20%。因此,当宫颈组织中、表酶的活性结果显示CN同正常宫颈及富颈父症组层出现Ⅱ型凹空细胞时可以推测有HPV16/1感织检测相比富颈癌同cN相比端粒酶活性的阳性染。而1型凹空细胞的HP6/1和HV16/8感染率差异有显著意义P<0.01)N端粒酶阳性率率差异无显著意义P>0.05)本研究中我们特也高于CIN(P<0.05可以看出随着宫颈癌前别关注含I型、Ⅱ型凹空细胞的宫颈癌及CN组织病变向宫颈癌的进展端粒酶的阳性率逐渐增高这中端粒酶检出率是否有差异即端粒酶检出率同凹表明端粒酶的激活同宫颈癌及CIN的发展有密切关空细胞分型的关系发现含Ⅱ型凹空细胞的组织端系。本研究中CN端粒酶活性比例即达51.6%,粒酶阳性率为10%而含1型凹空细胞的组织端CIN3端粒酶阳性率可达86.4%这提示端粒酶在癌粒酶阳性率为66,7%两者差异有显著意义(P<前病变中就有相当数量的表达端粒酶的激活可能0.05)这表明端粒酶激活同Ⅱ型凹空细胞有密切是宫颈癌发生的早期事件因而可作为判断宫颈癌关系。进一步表明宫颈癌及CN中端粒酶活化与及癌前病变发生的有用标志物。本结果同大多数人HPV16/18感染可能有密切关系的研究一致90二、宫颈脱落细胞中端粒酶活性的检测I Sajm M, Westra WH, Chen H, et al. Telomerase activity in the组织标本中端粒酶活性检测具有滞后性,且方differential diagnosis of papillary carcinoma of the thyroid. Surgery中华医学杂志2002年2月25日第82卷第4期 Natl Med J China, February25,2002,Vol82,No.4ell carcinoma of the uterine cervix. Am J Clin Pathol, 1998, 109: 153-biomarker for( pre )neoplastic cervical disease in scrapings and frozenpatients with abnormcal smear. J Clin Oncol 1998袁莉云,卞美璐罗杰,子宫颈湿疣的病理变化与人乳头状瘤病162238-2245,毒的检测,中华妇产科杂志99934354314 Kyo S Takakura M, Ishikawa H ret al. Application of telomerase assay4 Moyzis RK, Buckingham JM, Cram LS, et al. A highly conservedfor the screening of cervical lesions. Cancer Res 1997 57: 1863-1867repetitive DNA 5eμ uence C TTAGGGλ, present at the telomeres o15张梦真乔玉环史惠蓉,人宫颈癌脱涪细胞端粒酶活性检测的human chromosomes, Proc Natl Acad Sci USA 1988 85 16622-6626意义,中国妇产科临床5 Rhyu MS. Telomeres telomerase and immortality. J Natl Cancer Inst16 Coursen JD, Bennett WP, Gollahon L, et al. genomic instability an199587884-894telomerase activity in human bronchial epithelial cells durin6 Harley CB. Telomere loss: miotic clock or genetic time bomb. Mutatpillomavirus-16 E6 and E7genesRes,l991256:71-276Res997235:245-2537 Harley CB, Vaziri H, Counter CM et al. The Telomerase hypothesis of 17 Nakazawa H, Nakazawa K, Martel N,et al. Negative regulation ofellular aging. Exp Gerontology 992 27 375-382telomerase activity in human cells. Proc Am Assoc Cancer Res, 19968 Zheng ps, lwasaka T, Yokoyama M et al. Telomerase activation in vitro37560-560and in vivo cervical carcinogenesis. Gynecol Oncol 1997 66 222-22618 Nair P, Jayaprakash PG Nair MK et al. Telomerase r P53 and human9 Pao CC, Tseng CI, Lin CY et al. Differential expression of telomerasepapillomavirus infection in the uterine cervix. Acta Oncol 2000 39 65.activity in human cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasialesions. 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Telomerase activity as a本文编辑浏小梅)医学新闻心力衰竭患者死亡时间上存在性别差异孙宁玲马志毅2001年11月,在美国心脏病学会(AHA) Scientific患者仅在清晨的几个小时里最为危险sessions会议上报道男性致死性充血性心力衰竭以下简称Fahn认为“心衰在男性通常比女性更为危险。心衰的心衰)者绝大多数死于午夜或黎明但女性患者则在黎明某些临床特点可能影响24h生物节律男女之间激素分泌常见模式的差异也可能与这些发现有关。但我们对这些差异仍圣保罗医学院的巴西心脏中心医学博士 Jose Fabri报知之甚少"。躯体每日都有许多周期性的变化这些变化可道∵我们观察到许多充血性心衰的住院患者的死亡均发生能增加心脏事件的危险。如受心率、血压以及心脏收缩力等于早晨并观察到了死亡的时间分布,了解了是否在一天当因素影响氧需求在上午70时和中午达到高峰。血浆中中的某些时段其发生率更高。而从中我们获得了意想不到去甲肾上腺素和肾素活性(两者均协助血管收缩样在此的性别上的差别”。这种死亡时间分布的机制可能源于毎日时达高峰。既往研究已表明充血性心衰患者的血压、心率激素水平的生物性变化,即机体的24h生物节律。早先有在24h周期中存在异常。通常心率与血压在夜间下降但关未住院患者的研究表明心脏事件及猝死在晨起醒来后的心衰患者常无此表现。几个小时内达到高峰。而根据该项研究充血性心衰患者在进一步的研究应致力于阐明心衰死亡患者24h周期异夜间尤为危险同时首次发现在24h节律上性别间存在差常的机制,并研制出新的药物以校正其周期异常。例如BHAI the beta- blocker heart attack trial)发现阻滞剂可使心Fabri等研究了508例死亡病例男308例女200例年衰患者清晨的心源性猝死发生率下降44%。但β阻滞剂并龄令14~93岁平均59岁,以终末心衰住院。根据病情给予没有普遍在心衰患者中应用新近的研究表明此类药物可能每位患者标准化治疗包括卧床休息、饮食和血管紧张素转有助于心衰治疗换酶抑制剂、利尿剂、地高辛治疗。研究发现男性患者更易收稿日期2001-12-27)死于黎明50~659时和午夜的230~2359时而女性(本文编辑李群)