冰糖橙皮渣发酵产燃料乙醇的工艺优化

2012年第4期广东化工第39卷总第228期www.gdchem.con87冰糖橙皮渣发酵产燃料乙醇的工艺优化牛友芽12,高玉妹2,倪俊2(1.怀化学院生命科学系,湖南怀化418008:2.湘潭大学化工学院,湖南湘潭41115摘要采用纤维素酶、果胶酶和葡萄糖苷酶对冰糖橙皮渣进行水解,所得还原糖液接种异常毕赤酵母进行发酵,考察了酵母接种量、发酵时间、pH和发酵温度等单因素对乙醇得率的影响。单因素结果表明:接种量为12%、发酵时间72h、pH45、发酵温度33℃时乙醇得率最高。在此基础上设计L4(3正交实验。结果表明,最佳工艺条件为pH4.5,接种量12%,发酵时间72h,发酵温度30℃。在此条件下乙醇产率为0.2451gg,显著高于单因素实验(0.263gg)和正交实验结果(02329gg)[关键词]酶水解:发酵:冰糖橙皮渣:乙醇;工艺[中图分类号TQ[文献标识码]A[文章编号]007-1865(2012)040087-02Optimization of the fermentation Technology of Bio-ethanolProduction from Bingtang Sweet Orange Peel WasteNiu Youya, Gao Yumei, Ni Jun(L. Department of Life Science, Huaihua College, Huaihua 418008:2. College of Chemical Engineering, Xiangtan University, Xiangtan 411105, China)Abstract: The Bingtang sweet orange peel waste was hydrolyzed by celluase, pectinase and B-glucosidase. The resulting reducing sugar solution was inoculatedwith Pichia anomala and fermented. The effects of single factors including yeast inoculums, fermentation time, pH and fermentation temperature on ethanol yieldwere illustrated. Results showed that the optimum condition for single factor experiments were as follows: inoculums 12 % fermentation time 72 h; pH 4.5fermentation temperature 33 C. Then a Lg(3")orthogonal test was designed based on the forgoing results. Results showed the optimal fermentation technology wasoH 4.5; inoculums 12 %; fermentation time 72 h; fermentation temperature 30 C. Under these conditions, the ethanol yield could reach 0. 2451 g/g, significanthigher than those in single factor experiment(0. 2263 g/g) and orthodox experiments(. 2329 g/g)Keywords: enzyme- hydrolyze: ferment; bingtang sweet orange peel waste: ethanol: technology万,第一次超过巴西成为世界第一大柑橘生产国。柑橘果实榨了233114.1接种量对乙醇得率的影响其他条件同上,考察酵母接种量(6%、8%、10%、12%和汁后会产生40%50%的皮渣,这些皮渣的主要组成为果胶、纤14%,Vv)对乙醇产率的影响维素和半纤维素等,约占柑橘皮渣干重的20%30%。特定条1.4.2发酵时间对乙醇得率的影响件下,果胶、纤维素和半纤维素等能转化为可发酵性糖,在微生物作用下转化成乙醇,美国、希腊等国家已逐步开始利用柑橘皮12h测乙醇产率固定其他条件,酵母接种量为12%VV),发酵24h后,每隔菌种的性能对发酵效率有重要影响,已用于柑橘皮渣发酵的14.3初始pH对发酵的影响将发酵水解液调整至不同pH(3.9、42、45、48和5.1)后菌种主要有酿酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)378101、嗜鞣管囊接种12%的酵母菌悬液在33℃下静置发酵72h,测定乙醇产率酵母( Pachysolen tannophilus)y、马克斯克鲁维酵母( Klvveromvce144发酵温度对发酵的影marxianus、大肠杆菌( Escherichia coil)4和欧文氏菌( Erwinia/等将接种量为12%的酵母菌悬液接入到pH48的发酵水解液前期研究中,已从酒曲中分离得到一株可耐14%酒精度的异常毕赤中,在不同温度(27℃、30℃、33℃、36℃和39℃)下静置发酵母( Pichia anomala)菌株1,具备生产燃料乙醇的应用潜力72h,测定乙醇产率本研究拟以冰糖橙皮渣酶水解物为底物,探讨接种量、发酵1.4.5正交试验的设计时间、pH和发酵温度对异常毕赤酵母发酵产燃料乙醇的影响,在在单因素实验的基础上,分别选取对发酵影响较大的接种量此基础上设计正交试验,获得最佳工艺条件,为利用柑橘皮渣和(%)、发酵时间(h)、pH、发酵温度(℃)的4个因素的3个较优水平,燃料乙醇生产提供理论参考。用L3正交试验对发酵条件作进一步优化。正交试验表设计如表11实验1实验材料表1正交试验设计表请之。糖 Citrus sinensis Osbeck)果实购于湘潭大学购物中心Tab. 1 The experimental design of orthogonal test因1.2冰糖橙皮渣的酶水解水平接种量(A)%时间B)hpH温度①y℃生250mL锥形瓶中加入2g原料,分别加入100mLpH48磷酸柠檬酸缓冲液和纤维素酶(5mgg底物)、果胶酶(3mgg底物)和124.5葡萄糖苷酶酶液(2mgg底物),120rmin、48℃震荡培养48h,反应结束后,将三角瓶取出放入沸水中煮沸15min以终止反应,所得还原糖得率为6145%。1.3酵母菌悬液的制备1.5分析方法将活化好的异常毕赤酵母接种到YPD液体培养基中,在28乙醇得率采用气相色谱法测定,色谱条件为:安捷伦全温振荡培养箱中发GC-7890A,极性毛细管柱(25m×0025mm),氢火焰离子检测rmin下离心10min,用生理盐水将菌体洗涤3次后用无菌水稀释到(FD,氢气流量30mmin,载气氮气流量250 mL/min,空气流量4001.0×103个/mL。mL/min;程序升温:40℃保持1min,然后以15℃min的升温速率升14发酵条件至150℃;进样器温度180℃,检测器温度200℃;分流比50:1,进酶水解后,将水解液过滤,放入500mL三角瓶中,加入营养物样量04:以甲醇质(蛋白胨5%、酵母膏3%NHSO40.05%MgSO40.25%KHPO41.6数据处理和中国煤化工以g底物表示025%),灭菌后接入酵母菌悬液,33℃、pH4.8静置发酵84h每个实验3次软件进行將YHCNMHG采用SPSs30攵稿日期]2011-12-09[基金项目]湘潭大学大学生创新基金(201027资助[作者简介牛友芽(1976-),男,硕士,讲师,主要从事应用生物化学研究工作广东化工2012年第4期88www.gdchem.com第39卷总第228期2结果与分析随着接种量由6%增加到12%,乙醇产率由01756gg增加到2.1接种量对乙醇产率的影响02246gg。进一步增加接种量对乙醇产率无显著影响(p<0.05)。如图1所当增加异常毕赤酵母接种量能增加乙醇得率。0.250.250.200.15礼0.100100.0512%14%接种量温度/℃c图1接种量对乙醇产率的影响图2发酵温度对乙醇产率的影响Fig 1 Effect of Inoculum size on ethanol yieldig 2 Effect of Fermentation temperature on the ethanol yield22发酵温度对乙醇产率的影响(p<0.05)。发酵温度对乙醇产率的影响如图2所示。随着发酵温度从2723pH对乙醇产率的影响℃上升到33℃,乙醇产率从0.983gg增加到0.2263gg;进一步如图3所示,当pH为3.9和42时,乙醇产率偏低,分别为0030升高温度则会显著降低乙醇产自发酵温度为39℃时,乙醇产gg和0.0384gg,显著低于pH4.5时乙醇得率(.1885gg)。pH升高率为0.1594gg,显著低于其他发酵温度条件下的乙醇产率到4.8和51对乙醇产量无明显影响(p<005)0.250.2000.150.10.出0.100.054.8发酵时图3pH对乙醇产率的影响图4发酵时间对乙醇产率的影响Fig 3 Effect ofof pH on ethanol yieldFig 4 Effect of Fermentation time on ethanol yield24发酵时间对乙醇产率的影响正交试验直观分析见表2。由表2可以看出,因素C的极差R最发酵24h时乙醇产率仅为00532gg,发酵72h后的乙醇产率为的大小顺序为:C>A>B>D。不同影响因子的比较:接种量以k20.1825gg。发酵时间延长到84h,乙醇产率无明显提高(P<0.05)。值最大,为0.2103;发酵时间以k3值最大,为0.1852;pH以k值最2.5发酵最佳工艺条件的选择大,为0.2036:温度以k值最大,为0.1739。方差分析的结果如表3所示。与直观分析的结果一致,pH对表2正交实验结果乙醇产率影响极显著(p<0.01),其次是接种量和时间(p<0.05),温Tab 2 Results of orthogonal experiment序号因素乙醇产率最佳水平依次为C2A2B3D1。综合直观分析和方法分析结果,最佳A(gg°10.0912±00001h,发酵温度30℃。为了确认正交试验较优组合条件的再现性以C2A2B3D为发酵条件进行试验,结果乙醇产率为0.2451gg313330.176340001显著高于正交试验中的最高乙醇得率0.2329gg(p005)30.2164±0.0260310.2329±0.0016表3正交试验结果的方差分析5678920.1817±0.0240Tab 3 Orthogonal experiment results of analysis of varianc20.1348±0.0018显著性30.08960.0008017112.66210.1977±0.002201283.150K10.46420.44230.5217K20.63090.51920.5132中国煤化工K3042220.5557k0.15470.14740.12080.1739errorYHCNMHGk20.21030.17310.20360.1711k30.14070.18520.18130.1608极差R0.06960.03780.082800131(下转第90页)广东化工2012年第4期www.gdchem.com第39卷总第228期在一氯乙酸与BCD的物质的量配比为10:1,氢氧化钠与一在氢氧化钠与一氯乙酸物质的量配比为2:1、反应温度为60氯乙酸的物质的量配比为2:1,反应时间4h条件下,改变反应℃、反应时间4b条件下,改变一氯乙酸与B环糊精物质的量配温度,分别在40℃,50℃,60℃,70℃,80℃下完成反应,观比分别为7:1,8:1,9:1,10:1,11:1。由图3可知,随着察温度对取代度的影响。如图2可知,随反应温度的增加产物的氯乙酸用量的增加产物取代度呈现上升的趋势,当一氯乙酸超取代度和产率呈先上升后下降的趋势。在温度为60℃时取代度和过一定量时,取代度反而下降。这种现象的原因可能是由于一氯率达到最高值。较低温度致使取代度不高的原因可能是反应达不到醚化温而不利于亲核试剂的进攻,使SN2反应受到一定影响,故过量的度,在反应中产生了副反应使取代度降低,而温度高后可能导致氯乙酸会使取代度下降。整体而言,在一氯乙酸和BCD的物了一部分环糊精糊化,并发生交联,影响反应,使取代度降低质的量配比为9:1时,取代度和产率最高由这一系列可得知60℃是最佳的反应温度3结论23一氯乙酸与B-环糊精物质的量配比对CMCD取代度的影响鉴于本实验氢氧化钠与一氯乙酸的的物质的量配比对反应影响较小,在此不再对其进行深入研究讨论,对氢氧化钠与一氯酸物质的量配比参考文献记载定为1:2,总结上述实验结果可知:在一氯乙酸物质与B环糊精的量配比为9:1、反应温度为60m℃、反应时间4h的条件下,是合成羧甲基B环糊精的最佳反应条件参考文献备3李文德,周俊侠,张力田,环糊精的发展与改性研究门,山西食品工业1996,1:10-152]王瑾,陈均志.羧甲基B环糊精的制备工艺研究[食品科学,200912:98-1003]张毅民,张国栋,甘永江,等.系列单取代烷氧基2羟丙基B环糊精的合成与表征门,有机化学,2006:60-65氯乙酸与环糊精的摩尔比[4王超.B环糊精作用下甾体化合物的生物转化特性研究D].天津科技大学学报,2005,13:33-39图3一氯乙酸与B-CD的物质的量配比[S]高士样,王连生,黄庆国.羧甲基环糊精的合成及对卤代芳烃的增对 CM-P-CD的取代度和产率的影响溶研究[,环境化学,1999131-135Fig 3 Effects of molar ratio of monochloroacetic acid to B-CD(本文文献格式:陈龙然,刘雪粉,王江,羧甲基环糊精的合ondegree of substitution and yield of CM-B-CD成研究[J].广东化工,2012,39(4):89-90)(上接第88页)[7]Wilkins M R, Widmer WW, Grohmann K. Simultaneous saccharificationFo0s(2,2)=19F0n(2,2)=99and fermentation of citrus peel waste by Saccharomyces cerevisiae to produce3结论在单因素试验基础上,通过正交试验优化冰糖橙皮渣发酵产8]Wilkins M R, Suryawati L, Chrz D, et al. Ethanol production乙醇的工艺,以乙醇产率作为主要评价指标,得出各因素对提取Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces marxianus in the presence效果影响的主次顺序依次为:pH>接种量>发酵时间>发酵温go. World Joumal Microbiology Biotechnology.20023(8)度。通过直观分析和方差分析,得出冰糖橙皮渣接种异常毕赤酵母发酵产乙醇的最佳工艺条件为:pH4.5,接种量12%,发酵]sharma N, Kalra K L, Oberoi H S, et al. Optimization of fermentation parameters间72h,发酵温度30℃,在此条件下乙醇产率为0.2451g/g,显著for production of ethanol from kinnow waste and banana peels by simultaneous高于单因素实验和正交实验结果。本研究为开发和利用柑橘皮渣saccharification and fermentation[J]. Indian Joumal of Microbiology, 2007, 47(4提供了一定参考。310-316[10JBoluda-Aguilar M, Garcia-Vidal L, Gonzalez-Castaneda F del P,et参考文献al. Mandarin peel wastes pretreatment with steam explosion for bioethanolproduction[]. Bioresource Technology, 2010, 101(10): 3506-3513妹,陶能国等.硫酸水解冰糖橙皮渣工艺研究门,食品[1llLohrasbi M, Pourbafrani M, Niklasson C, et al. Process design and工业,2010115-118.economic analysis of a citrus waste biorefinery with biofuels and limonene as2]Wilkins M R, WW,Grohmann K,et al. Hydrolysis of grapefruit products(]. Bioresource Technology, 2010, 101(19): 7382-7388peel waste with cellulase and pectinase enzymes[J]. Bioresource Technology[12]Pourbafrani M, Forgacs G, Horvath IS, et al. Production of biofuels2007,98(8):1596-1601limonene and pectin from citrus wastes[J]. Bioresource Technology, 2010[3] Grohmann K, Baldwin E, Buslig B. Production of ethanol from101(11):4246-4250enzymatically hydrolyzed orange peel by the yeast Saccharomyces[13JOberoi H S, Vadlani P V, Nanjundaswamy A, et al. Enhanced ethanolcervisiae[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 1994, 45/46(1):production from Kinnow mandarin(Citrus reticulata) waste via a statistically315-327simultaneous saccharificationprocess[J]. 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