比伐卢定的聚乙二醇化修饰

2013年第21卷合成化学vol.21,2013第1期,099~102 Chinese Journal of Synthetic ChemistryNo.1,099~102·制药技术比伐卢定的聚乙二醇化修饰何燕,邓言波,王良友21.苏州大学医学部放射医学与防护学院,江苏苏州215123;2.苏州中科天马肽工程中心有限公司,江苏苏州215101)摘要:将比伐卢定(BVLD)多肽链7甘氨酸(ly)用半胱氨酸(Cys)取代,以聚乙二醇(PEG)定点修饰巯基,采用多肽固相合成法制得[Cys-bld(2)2与mEG-MAL(3a-3c)偶联合成了三个聚乙二醇化修饰的比伐卢定衍生物—【 Cys mPE200】-((mpeg50m-db和[cy(me10000-M)-Bvld(1c),其结构经MS确证。p和T评价结果表明,1a1c均表现出良好的抗凝活性,尤其是1b的抗凝活性优于比伐卢定。关键词:比伐卢定;聚乙二醇化修饰;多肽合成;抗凝活性中图分类号:0629.72;R914.5文献标识码:A文章编号:1005-1511(2013)01009904 PEGylation of Bivalirudin HE Yan', DENG Yan-bo', WANG Liang-you? (1. Institute of Radiological Medicine and Protection, Soochow University, Suzhou 215123, China; 2. Suzhou ChinaTech Peptide Co. Ltd., Suzhou 215101, China) Abstract: Three PEGylation bivalirudin (BVLD) derivatives, Cys( mPEG2000-MAL)]'-BVLD (1a), Cys( mPEG5000-MAL) ]'-BVLD(1b) and Cys(mPEG10000-MAL) ]'-BVLD(),were synthesized by addition reaction of mPEG-MAL (3a ~3c)and Cys]'-BVLD()which was prepared by replacing the 7-glycine(Gly) of BVLD by cysteine( Cys)with the solid phase peptide synthesis. The structures were confirmed by MS. The results of PT and TT evaluation showed that la~ exhib- ited good anticoagulation activities, especially 1b was better than bivalirudin. Keywords: bivalirudin; PEGylation; peptide synthesis; anticoagulation activity比伐卢定(BLD)是由20个氨基酸(D-he-250g,价格昂贵。其在肾功能正常的患者体内proa- Pro-Cly-Asp-Phe--gly-gly-gly-a-gly--lu-的清除半衰期为25min,虽然比伐卢定于2000年lu-e-pro-glu-glu-tyr-eu)组成的水蛭素的衍被批准用于经皮冠状动脉腔内血管成形术的抗凝生物,是凝血酶的直接可逆的二价抑制剂U,可治疗,在2005年被批准用于接受经皮冠状动脉介以与凝血酶的催化位点和阴离子结合位点(底物入治疗的抗凝治疗,但是昂贵的价格限制了其识别位点)结合2BVLD于2000年12月15日在临床上的应用。因此,开发长效、安全经济的被美国FDA批准上市。类似药物十分必要。蛋白质经聚乙二醇化修饰Bvld是一种合成的多肽药物,单次剂量为( PEGylation)后能显著改善其特性,如增加蛋白收稿日期:2012-0705;修订日期:2012-11-01基金项目:江苏省大学生实践创新训练计划”资助项目(5731504610)作者简介:何燕(1990-),女,汉族,新疆昌吉呼图壁人在读本科生,主要从事多肽的合成与修饰研究。通信联系人:王良友,副研究员,e-mail: liangywang gmail.com100合成化学Vol.21,2013质对酶的稳定性、延长蛋白质在血浆中的半衰期、CH2l2(5mL)溶液,Et6mmol和对甲苯磺酰降低抗原性和免疫原性等4,已有多个PEG修饰氯6mmol,搅拌下于室温反应20h(TLC监测)的蛋白药物上市。于40℃减压旋蒸除去溶剂,加预冷无水乙醚沉本文将BVLD多肽链7-甘氨酸(Gly)用半胱降,过滤滤饼用二氯甲烷溶解,依次用0.1%柠氨酸(Cys)取代,以PEG定点修饰巯基,采用多肽檬酸钠溶液(3×10mL),饱和NaCl溶液(3×足固相合成法制得[Cys]-bvld(2);2与mG量)洗涤,无水Na2SO4干燥12h,于40℃减压旋MAl(3a3c)偶联合成了三个PEG修饰的BV-蒸除去溶剂,乙醚沉降,抽滤滤饼干燥得白色粉LD衍生物[Cys(mE2000-)]-Bld末mpeg-otsia-ic)(a),[Cys(m5000-mal)-bvld(1b)和在反应瓶中依次加入Ia~Ic1mmol的mCys(m1000m)-Bvd(1c),其结构经(10m)溶液,邻苯二甲酰亚胺盐(pI)6mmol,MS确证。PT和TT评价结果表明,1a~1c均表N2保护下于120℃反应4h于90℃减压旋蒸现出良好的抗凝活性,尤其是1b的抗凝活性优于除去溶剂依次加入无水乙醇与水合肼,回流反 BVLD.应2h。于60℃减压旋蒸除去溶剂,残余物用二氯甲烷溶解,过滤,滤液依次用水(3×10mL),饱1实验部分和NaCl溶液(3×足量)洗涤,无水Na2SO4干燥1.1仪器与试剂12h,于40℃减压旋蒸除去溶剂,乙醚沉降,抽创新通恒半制备高效液相色谱仪[ Phenome-滤滤饼干燥得白色粉末mpeg-nh2(a-c)nexc8柱,250mm×30mm(100A,10),流动在反应瓶中加入Ⅱa~Ⅱc1mmol的二氧六相A:0.05%TfA水溶液,B:0.05%TfA(三氟乙环(40mL)溶液搅拌下于80℃加马来酸酐4酸)70%CHC/H2O,流速20mL·min-1,检测mmol,反应30min于55℃减压旋蒸除去溶剂,波长215mm];戴安U3000型高效液相色谱仪乙醚沉降抽滤滤饼用醋酸酐溶解加入无水醋[HPlc, Prosphere C188柱,250mm×4.6mm(100酸钠,搅拌下于100℃反应45min(反应液由淡黄A,5μ),流动相同前,流速1m·min-];Bruk-色逐渐变为褐色液体)。加水(10倍体积),分液, er MTQ型质谱仪。水层用CH2Cl2(3×10mL)萃取,合成并有机层,固相合成载体CTC树脂(原始替代度为1.3用饱和NaCl溶液(3×足量)洗涤,无水Na2SO4mmolg),dcc(n,n二环基碳二亚胺)干燥12h,于40℃减压旋蒸除去溶剂,乙醚沉降,HBt(1-羟基苯并三氮唑)以及10种Fmoc-保护抽滤,滤饼干燥得淡黄固体3a~3c氨基酸,上海吉尔生化公司;FA, Acros;EDT(乙Ia~3c的产量及产率见表1二硫醇)和TMBS(三甲基溴硅烷), Fluka;聚乙二(2)[ys]-bvld(2)的制备醇的平均分子量为m2000-0H,mpe5000CTC树脂15.00g,HBt和HBTu为缩合剂,H和mE10000-H, Sigma;其余所用试剂为按照反应的投料比,称取相应量的Fmoc-leu-oh,分析纯。 Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc- Pro-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp1.2合成 (OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH,(1)mpeg-mal(3a-3c)的合成通法在反应瓶中依次加入mp-OH1mmol的(pb)-oh,根据[Cys-blD的氨基酸顺序,按表1a~3c的产量及产率 Table 1 Output and yield of Ia~3c mPEG2000() mPEG5000(5g)mpe10000(10g) Comp Ia IIa 3abⅡb3b IcⅡc产量g3.624.401.421.533.150.611.001.800.36产率/%72.488.028.442.379.543.065.451.458.4第1期何燕等:比伐卢定的聚乙二醇化修饰101moc-a.obt. HATUHATU.12min2%Kn的吡溶液(1 mmol,树脂透明为阴检dmf min DIPEA,DMF, CTC洗涤3×1min 2-crc min2kcn啶溶液(1mml树脂有颜色为阴性6xdm2x1 10 min DBLK6%三酮的乙醇溶液,80%苯酚的乙醇溶液洗脱保护图1Fmoc固相多肽合成2CTC的流程图 Figure 1 The flow chart of the Fmoc solid phase peptide synthesis of 2-CTCv六氢吡啶):V(DMF)=1:3标准的Fmoc固相多肽合成方法(图1)合成D-1.95(2),lu4.06(4),Pro2.92(3),arg0.96 Phe-Pro-Arg(Pbf)-Pro-Gly-Gly-Cys'()-Gly-Asn(1),ly4.21(4),Ty1.06(1),Phe1.92(2) (Trt)-Gly-Asp OtBu )-Phe-Glu OtBu)-Glu( Ot- 1.01(1), Leu 0.97(1). Bu)-lle-Pro-Glu( OtBu )-Glu (OtBu)-Tyr (tBu)-leu-ctc-ct).按照8mL·g树脂用量配1.31的抗凝活性评价制并加入裂解液,以混合溶剂[V(TFA):V(苯甲(1)1的凝血酶原时间(PT)测定硫醚):V(EDT):V(苯甲醚)=90:5:3:2]为裂将PT试剂和受检血浆置37℃水浴中预温5解液,于0℃反应90min。过滤,滤液旋转蒸发除min取试1支,加人受检血浆0.1mL,一定量去TFA,加冷冻无水乙醚(6倍体积)沉淀出白色的比伐卢定或1(用pH7.4的Tris-HC缓冲液配固体,3000rpm离心5min,滤集固体用水溶解,制成所需终浓度),置37℃水浴中预温30s,再加冰冻干燥至恒重得白色干粉2粗品62mg人预温的PT试剂0.2mL,混匀,立即启动秒表计2粗品经HPLC纯化得2,纯度大于95%时。不断地倾斜试管至液体流动缓慢趋于停止(H),其结构经MS和氨基酸组成分析确证。时,记录所需时间。重复三次,取平均值,空白对由MS分析可知,在1112.2处有主峰,与理论分照为Tris-HCl缓冲液,测试结果见表2子量2223.99分子带两个电荷一致。2经酸性水表21的T评价数据解(6mol·L盐酸水溶液,于110℃反应22h, Table 2 PT evaluation data of 1下同)的氨基酸组成实测值与理论值(括号内)相等质量浓度等摩尔浓度符:Asp1.99(2),Glu4.11(4),Pro3.09(3),Comp终浓度凝固时间/s终浓度凝固时间/sArg0.96(1),ly4.21(4),Tyr1.07(1),Phe1.92(2),e0.99(1),eu0.98(1)。空白对照11.92(0.40)-11.92(0.40)(3)1a~1c的合成通法比伐卢定2.041.9(1.49)2.041.9(1.49)在反应瓶中加入2的水(10mL)溶液,用5%22.026.5(0.85)2.026.5(0.85)碳酸氢钠溶液调至pH7~8,加入3a~3c,于室温1a2.015.0(0.15)4.040.3(2.08)反应至终点(HPLC监测)。HPLC分离提纯得12.016.2(0.64)7.051.4(0.711a~1c,纯度大于95%, MALDI--tof-ms分析结12.015.8(0.90)12.044.0(0.80)果表明,在4232附近有一系列峰,相邻两峰分子量相差约44,具有聚乙二醇的典型结构特征。经终浓度/·m,凝固时间栏括号内为标准差酸性水解的氨基酸组成实测值与理论值(括号由表2见,1a~1c不仅在等质量浓度测定条件内)相符。1a:Asp1.99(2),Glu4.11(4),Pro下仍保留了一定的抗凝活性;而且在等摩尔浓度3.09(3),Ar0.96(1),Gly4.21(4),Tyr1.07下也保持了良好的抗凝活性,其中1b的抗凝活性(1),Phe1.92(2),0.99(1),e0.98(1)。优于比伐卢定。b:Asp2.00(2),glu4.31(4),Pro3.18(3),(2)1的凝血酶时间(TT)测定Arg1.03(1),gly4.13(4),tyr1.02(1),Phe取受检血浆0.1mL于试管中,加入一定量的1.82(2),e1.06(1),Leu1.03(1)1c:Ap比伐卢定或1(用p7.4的ris-Cl缓冲液配制102一合成化学Vol.21,2013成所需终浓度),置37℃水浴中,预温5min,再加果见表4。由表4可见,1a~1c仍保持了良好的0.1mL标准化“凝血酶”试剂,同时启动秒表抗凝活性,其中,1b的抗凝活性最佳。记录血浆凝固时间。重复三次,取平均值,测试结果见表3。从表3可以看出,1a~1c均具有较好2结果与讨论的抗凝活性(正常对照平均值18.0s)。比伐卢定的构效关系研究表明,其氨基端带表31的T评价数据正电荷区域d-phe-pro-arg-Pro)和羧基端带负电 Table 3 evaluation data of 1荷区域(Asn-ly-asp-he-glu-lule-pro-glu-glu-Comp终浓度/gml凝固时间/s标准差/sy-e)是其与凝血酶结合的两个关键区域而比伐卢定0.0529.01.427位或8-位的甘氨酸进行聚乙二醇修饰是理想的20.2029.10.81位点。初步活性评价表明,本研究合成的三种不 1a0.0532.81.11同平均分子量的1a~1c能保持较好的体内抗凝 1b0.0532.51.33活性,在相同摩尔浓度下,1b的抗凝活性优于比 le0.1026.60.70伐卢定,有望进一步开发成具有比比伐卢定更长半衰期的抗凝药物。表41的APTT评价数据(等质量浓度) Table4 APTT evaluation data of 1参考文献Comp凝固时间/s标准差/s1]eedbd. 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(II) ion selective electrodes with PVC membranes Synthesis and study of the use of heterocyclic thiosem- based on two bis thioureas as ionophores: 1, 3-Bis icarbazones as signaling acaffolding for the recognition (N-benzoylthioureido benzene and 1, 3-bis N-fu- of anions[ J]. J Org Chem, 2010,75 2922-2933. roylthioureido) benzene]. Joumnal of Hazardous [11] Wilson D, Aradab M A, Alegreta S, et al. Lead Materials,2010,181:140-146.