合成乙醇重组乳杆菌的研究

934生物学通报2007年34(5)合成乙醇重组乳杆菌的研究夏子芳王正祥(工业生物技术教育部重点实验室和江南大学生物工程学院无锡214122)摘要:将含有 Zymomonas mobilis乙醇合成途径的关键酶基因的片段 Ptac-pde和 Ptac-adh,分别/同时接入phy3 300PLK pBBRIMCS载体中,得到了phy-pAB-等重组质粒,分别转化入几株乳杆菌。在42℃下进行乙醇发酵试验,结果表明:在 Lactobacillus plartanum CICIM0080中同时引入基因pdc、adhB有效地将碳代谢流导向了产乙醇方向,重组B0080(pY-P)发酵6.7%葡萄糖60h分别产生0.4%(VV)乙醇,为原始B0080的67倍;而将pdc、adhb基因同时引入. amylowonu112和 acidophilus0068,能检测到相当于原始菌2倍的乙醇产出在重组菌发酵过程中,仍有大量的乳酸产出,在引入产乙醇基因的同时敲除乳酸脱氢酶基因,将有可能使乳杆菌的代谢流向更有效地转向产乙醇途径。关键词:乳杆菌,乙醇,Ptac-pdc,Ptac-adhB中分类号:Q78文献标识码:A文章编号:02532642075-0934-05 Recombinant Lactobacilli for Ethanol Production' XIA Zi-Fang WANG Zheng-Xiang" Key Laboratory of Inadustrial Biotechnology, Ministry of Educarion and School of Biotechnology, Wuxi 214122) Abatrac: Recombinant plasmids pHY-PA, pBBR-PA were constructed in which genes pde and adh B were placed under the control of tac promoter, ated into Lactobacillus strains for ethanol production. Preliminary ethanol fermentation nsing these Lactobacillus strairs and their recombinants was carried out using 42C ae fermentation temperature. The results indicated that introducing pdc and adhB. athanologe was succesafully constructed in L. plantanum CICIM B0080. 0.4% (VIY) ethanol wen detected at end of fermentatin with 6.7% slucose, and that is 67-fold an the wild-type B0080. Two fold of athanol production was detected in L. amylowonus B0I12 pHY-PA) and L. acidophilw B0068 (PBBR-PA). Introducing both pde and adh B, and mecanwhile knock-outing the lanctate dehydrogmase gene may better convert carbon fluax to ethanologenic direction. Key words: Lactobacillus, Ehanol, Ptac-pde, Ptac-adhB乳杆菌是一类革兰氏阳性兼性厌氧菌,适宜生产条件。因此,对乳杆菌的代谢途径进行改造,有长温度高达40℃~50℃,能在较低的pH和较高盐望获得新型乙醇发酵菌株。另一方面,乳杆菌作为浓度的环境下生长;其中大多数能够代谢包括五碳发酵乳制品的主要生产菌种,适量乙醇的产出有利糖和六碳糖在内的多种糖类能产生具有抑菌或杀于食品风味的改善,能与酸类物质形成特有的香菌作用的细菌素,在发酵生产中能起到抑制其他细味,给人以提神刺激的感受发酵乳制品中的微量菌的作用。同时,乳杆菌是目前基于酵母菌的乙醇乙醇能促进消化腺机能增强,刺激肠胃蠕动,促进发酵中的主要污染菌21,与酵母竞争性利用培养有机体的代谢。基中的碳源和各种营养成份,其代谢产物能影响酵乳杆菌中,代谢产生的大量丙酮酸经乳酸脱氢母的生长,以致酒精产量的降低;但这也从另一个酶(D;1.1.1.27)催化而转化为乳酸,通过强化细侧面反映出乳杆菌能够适应乙醇发酵过程中的生胞内的丙酮酸脱羧酶(PDC EC4.1.1.1)和乙醇脱氢酶(ADH;EC1.1.1.1)的活性来扩增目标途径,是新世纪优秀人才支持计划(No.net-04-9704)通讯作者E-mail zwarg sytu.d.cn收日期:2007-01-19修回日期:2007-04-02007年34(5)微生物学通报935构建产乙醇乳杆菌的主要策略。本研究以已实现植物乳杆菌( Lactobacillus plantanum)CM在E.coli中表达的重组质粒ptac-A为基础,构B0080、噬淀粉乳杆菌(L. amylovorus)B0112、嗜酸乳建了phy -PA- pBBR--p系列质粒在此基础上构建杆菌(L. acidophilus)B0068,克隆宿主菌大肠杆菌乳杆菌重组菌,探索重组乳杆菌的乙醇合成能力。( Escherichia coli)JM109,由江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心 (cicim-cu, http ://cicim-cu.1材料和方法ytu.edu.cn)保藏。本研究中所使用及构建的菌株1.1菌株和质粒和质粒见表1表1株和质粒 Strain or plasmid Characteristies and description Source or reference Strains lactobacillus plantanum B0080 Wild-type strain Isolated from pickle fermentation facility L. amylowor B0112 wild-type strain, capeble of raw starch degrading7] L. acidophilus B0068 wild-type strain, low pH tolerance CICIM-CU Escherichia codi JM109 Cloning strain CICIM-CU Etac-PA Kanr: hartboring pde and adh B that were placed under the control of [6] tac promoter, reepectively pHY300PLK Amp', Tet'; E. oodi- Bacillu sp, shuttle vector CICIM-CU pHY.pdeA mp', Tet'; harboring Ptac-pdc This work pHY-adh Amp', Tet': harboring Plac-adh B This work pHY-PA Ampr, Tetr: harboring both Ptac-pde and Puac-adhB This work pBBR1MCS-5 Gn': board-bot-range vector CICIM-CU pBBR-PA Cm'; harboring both Ptac-pde and Ptac-adhB This work1.2培养基和培养条件1.4DNA操作技术乳杆菌的培养采用MRS培养基(每升含有10gDN片段胶回收产物纯化用华舜试剂盒进牛肉膏,10g蛋白胨,5g酵母抽提物,20g葡萄糖,1g行质粒DNA的提取、酶切、连接、转化等参照文献吐温80,2gk2HPO4,5g乙酸钠,2g柠檬酸二铵,0.2g[8]进行。Mg4.7h20,0.055g MnSO4.H2O,pH6.2~6.5)在1.5转化方法42℃静置培养24h~48h。含1.3%琼脂的固体MRS乳杆菌的电转化按照文献[进行大肠杆菌培养基(含相应抗生素)用于转化子的筛选和计数。的转化按照文献[8]进行。大肠杆菌的培养使用LB培养基(每升含有10g胰1.6酶活测定蛋白胨、5g酵母浸提物、0gNaC1),37℃下培养。含重子用MRS培养基培养过夜,离心收集菌1.3%琼脂的培养基(含相应抗生素)用于转化子的体,以磷酸盐缓冲液(pH6.5)洗涤悬浮,超声波破筛选。壁。酶活测定参照文献[6]进行。1.3酶与试剂1.7发酵试验.牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)、T4DNA连接酶、各以含有6.7%葡萄糖的MRS培养基为发酵培养种限制性内切酶和蛋白质分子量标准均为晶美生基,50mL三角瓶中装液量为50mL,每瓶加入2g物工程有限公司产品;胶回收试剂盒为上海华瞬生CaC3发酵于42℃下进行。发酵液中葡萄糖和乳物技术有限公司产品。其他试剂药品为国产或进酸含量用生物传感仪测定。乙醇浓度采用气相色口的分析纯和生化试剂。谱法测定,色谱参数为:汽化室温度200℃,检测器936微生物学通报2007年34(5)(D)温度260℃,传输线温度130℃。载气压力上,构建ph-pdc、phy-adhphy-pa,和pbbr-pao58.8kpa,流量2mlmin;助燃气空气流量400mL/min;首先以 BamHI和Sal酶切质粒 pEtac--pa同时回收燃气H2流量47m/min。顶空瓶平衡温度:70℃,平Ptac-pdc(约2.3kb)和tac-adhB(约1.6kb)片段。将衡时间:30min。前者插入pHY300PLK的 BamHI位点,得到pHYpdc;将后者插入以BamH和Sal酶切的2结果phy3pl载体,得到phy-adh;再将Ptac-pdc片2.1重组质粒的构建段插入py-adh的 BamHI位点,得到pHy-A(图在本实验室先期构建的质粒 pEtac--A的基础1)采用相似方法构建获得重组质粒pbbrpa all adh /Kan(R) Ptac BamHI mHI pEtac-PA BamH, 9.2kb pdc BamH I BamH Ic BamHI SalI Ptac-adh BamHI Ptac-udh BamHI Instrt Sal ORI ORT Plac-adh pHY-pde /AP69kb Ptac pHY-adh RamH I Haml I ori-pAMal6.4kb ori-pAMal ori-pAMal TCr OR] -adh Pac pHY-PA8.4kb ri-pAMal Cr图】重组质粒phy-pdc、phy -adh- pHY--pA的构建过程2.2重组乳杆菌PDC、ADH酶活测定2.3重组菌的初步酒精发酵对重组菌中的C和ADH酶活进行了测定挑取各重组菌及原始菌单菌落接种于10mL含(表2)。酶活测定的结果表明,pdc、adhB基因在有相应抗生素的MRS培养基中,42℃静置培养过夜. plantanum B0080中成功实现达对后,将其作为种子液,以1%(VV)接种到50mL含约. acidophilus B0068、l. amyloworus0112及其相应6.7%葡萄糖的MRS培养基,其中加入了2 g CaCo,,3,重组菌进行DC和ADH酶活测定,结果同样表明:42℃静止发酵。发酵6.7%葡萄糖60h:l. plantanum重组菌的C和ADH酶活均相对于其原始菌株有B0080、B0080(phy-pdc)只能产生约0.006%()所提高(表2),pdc、adB基因在这两株乳杆菌中同的乙醇;重组菌B0080(phy-adh)、0080(phy-pa)分样实现了表达。别产生0.33%、0.4%(VV)乙醇(图2)2007年34(5)微生物学通报·937表2重组菌中PDC和ADH酶活 Specific activities(U/mg) Enrymes L. plantanum L. acidophilu L.amyloworu B0080 B0080( PHY.) B0080( pHY-adh) BO080( PHY-PA) B0068 B0068( PBBR-PA) BO112 B0112( PHY-PA)DC0.15820.20380.27300.30710.38420.72680.05140.3011ad0.32300.34602.73023.31630.09880.490600.501805450.2010.00122436486001201224364860h墨12243648 thh +Lplarntarsan, -Lplantantm *pHY-pde, -o-Lpluntamum+pHY-adh,+pHY-PA图2 Lactobacillus plantanum及重组菌的酒精发酵根据酶活测定和乙醇发酵试验结果,各重组菌3讨论的PDC的酶活为原始菌的1.3~1.9倍,重组菌的乙乳杆菌能代谢多种糖类,能在较为严峻的环境醇产量和ADH酶活成正相:B0080(phy-pc)和条件下生长,是发酵产乙醇的合适改造选菌。但原始菌相近,只能产生约0.006%(VV的微量乙在乳杆菌中,代谢产生的大量丙酮酸都经乳酸脱氢醇;在B0080(phy-adh)、b0080(phy-Pa)中能检测酶(LDH;1.1.1.27)的催化而转化为乳酸,仅有极少到约为原始菌10倍的ADH酶活,同时两重组菌发量的乙醇经异型乳酸发酵产生。将“产乙醇基因”酵6.7%葡萄糖60h分别产生0.3%、0.4%(VV)引入乳杆菌是构建产乙醇的乳杆菌的主要策略。乙醇(图2);且B0080(pHY-PA)的乙醇产量比本研究中三菌株的最适生长温度约为42℃,适B0080(phy-adh)略高,说明在L. plantanum B0080于目前发酵工厂中普遍使用的发酵培养温度,同中同时引入基因pdc、adhB最有效地将碳代谢流导时,较高的发酵温度有利于乙醇的收集亦可防止染向了产乙醇方向。菌;且三菌株各具特点,具有重要的工业应用价值L. acidophilus B00068、l. amyloworus B00112发酵和使用潜力。其中菌株L. plantanum B0080分离自6.7%葡萄糖60h仅产生0.6×10-(V乙醇,而蔬菜发酵工厂,生长速度快,代谢旺盛。本文研究重组菌B0068(pBBr-pa)bo112(phy-A)别合了在该菌株中分别引入pdc基因和/或adhB基因成1.2×10-、1.0×10-3(VV)的乙醇。时,重组菌的乙醇发酵情况。酶活测定和乙醇发酵938微生物学通报2007年34(5)试验结果说明:在L plantanum B0080中同时引入方面,若利用本研究所构建的重组乳杆菌进行乳制基因pdc、adhB最有效地将碳代谢流导向了产乙醇品单一菌种发酵,产生的乙醇有利于改善乳品的口方向。菌株L. amyloworus BO0112于1981年由感不至于掩盖乳酸菌发酵的风味,又能刺激肠胃 Nakamura报道,能够利用多种碳源且具有生淀粉蠕动,促进新陈代谢。降解能力;菌株L. acidophilus B0068能够适应酸性的培养环境,其最适生长pH为4.5,自身代谢产生参考文献的乳酸不易抑制菌体生长,且较低的pH环境有利 Narendranath N V, Hynes S H. Thomas C, al. Appl Environ于该菌株的纯培养不易染其他杂菌。将pdc基因和 Microbiol,1997,63:4158-4163adhB基因同时引入上述两菌株:检测到的乙醇为kl408.原始菌的2倍。我们还考察了重组菌L. amylovorus3】杨具田草1996,1:37-39B0112(H-PA)直接利用4%玉米淀粉合成乙醇的4】刘振民,骆承摩食品工业2000:21-23情况:发酵终了能检测到0.083%(VV)的乙醇产[5李华丘文周广祥中牛1:3出,而原始菌B0112仅产生0.6×10-3(VV)乙醇。6孙金风,徐敏,张峰,等生物学报,2004(5):60本研究还发现,重组菌的丙酮酸代谢主要还是流向产乳酸途径,我们正进一步设计,在引入pdc和 7] Nakamuza L. Int J Syat Bacterial, 1981, 31: 56-63. 8 Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. Molecular Cloning: a LaboratoryadhB基因的同时,利用同源重组敲除乳酸脱氢酶 Manual, Ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Pree,基因,打断乳杆菌中由丙酮酸代谢产生乳酸这一主1989流代谢途径,以期获得乙醇高产重组乳杆菌。另一】 Tpompon Cllis Micobiol Methods67-7新书推介科学出版社生命科学编辑部新书推介精编蛋白质科学实验指南(Short Protocols in Protein Science)[美]JE.科里根等编李慎涛等译978-703-018086-0定价:120.002006年12月出版本书是《最新蛋白质科学实验指南》( Current Protocols in Protein Science;CPP)一书的精编版本,内容全部取材于该书和每季度更新的服务手册,其详细提供了多种实验方案,并包含实验材料、步骤和每种技术的参考文献等信息,可使有经验的研究人员将其作为独立的实验室指南来使用。由于蛋白质具有多样性,其分析也必须包括很广范围的结构和理化方法,因此每个研究人员都必须尽可能多的同时掌握最新方法和传统方法。本指南中既包括特定的详细方案,也包括使方法适应手头特定项目的策略,能够帮助读者进一步深人进行蛋白质科学和相关领域的研究。欢迎各界人士邮购科学出版社各类图书(免邮费)邮购地址:100717北京东黄城根北街16号科学出版社科学分社,联系人:阮芯联系电话:010-6403462(带传真)更多精彩图书请登陆站: http: //www. lifescience. com. cn,.com.cn,欢迎致电索要书目