酶法测定甲醇酵母发酵液中甲醇浓度

第11卷第2期生物技术Vol.11 ,No.22001年4月BIOTECHNOLOGYApr 2001thus the increase of its stability.It is found that chymotrypsin remained up to 97% of initial catalytic ac-tivity when there have50%( v/v )glycerol and the moderate pressure of 50 MPa in reversed micelles .Key words :kchymotrypsin ,reserved micelles icatalytic and stability iffeet of pressure itemperature iglyc-中图分类号:Q814.9文献标识码:A文章编号:1004-311X 2001 )02 - 0023-03酶法测定甲醇酵母发酵液中甲醇浓度黄秀东'杨红2张高峡'李树刚' ,于廷和3( 1.重庆雨水生物医药研究所重庆4000602.重庆大学生物工程学院重庆400044 ;3.重庆医科大学医学超声工程研究所重庆400016)摘要:用醇氧化酶-过氧化氢酶联合的酶促反 应法测定甲醇酵母发酵诱导阶段变化的发酵液中甲醇浓度建立一种能够快速测定发酵液中甲醇浓度的方法。测定的最佳浓度范围是0.5% ~ 5%。关键词发酵;甲醇酵母;甲醇醇氧化酶甲醇酵母( Pichia pastoris )发酵的诱导阶100ml0. 1M磷酸盐缓冲液( pH7.0 )溶解4C段甲醇浓度的控制非常关键通常只有配备保存备用。酶电极才能监控发酵液中甲醇浓度的变化,1.1.2 酚溶液:苯酚( AR )200mg ,100ml蒸馏但是酶电极价格昂贵,使用寿命有限。而目水溶解。前用于测定酒类甲醇含量的国标方法1.1.3 工作液:临使用前将上述1.1.1和( GB5009.48- 85 ),不论是气相色谱法还是1.1.2试剂(酶酚)等体积混合。亚硫酸品红比色法均需要昂贵或复杂的仪1.1.4 甲醇标准溶液器并且还要对样品进行预处理不适合对动甲醇水溶液:用蒸馏水配制一系列不同态发酵过程监测。浓度梯度的甲醇( AR溶液。我们采用醇氧化酶-过氧化氢酶联合的甲醇发酵液将甲醇(工业级)加入未诱酶促反应法(简称AOX- CTR法) ,能对成分导阶段的甲醇酵母发酵上清液中,配制同甲复杂而又不断变化的发酵液中甲醇浓度进行醇水溶液相应浓度梯度甲醇发酵液溶液。跟踪测定。无需对发酵液进行预处理,在甲1.1.5 仪器:HP8453型分光光度计。醇浓度为0.5% ~ 5%范围内,可对其浓度进1.2 方法行快速测定。1.2.1 原理:甲醇等低级醇经醇氧化酶( AI-cohol Oxidase AOX )催化,生成相应的醛及过1材料与方法氧化氢而后者在过氧化氢酶( Catalase .CTR )作用下，分解出原子态氧将无色还原型4-氨基安替比林与苯酚,偶联氧化缩合成红色1.1 材料醌亚胺类化合物(最大吸收峰322nm和1.1.1 酶试剂:醇氧化酶( Biozyme Laborato-508nm)_醌亚胺类溶液的颜色深浅在一定范ries )1200IU过氧化氢酶(_上海生工)12001U ,围内与甲醇浓度成正比,可用分光光度法定4一氨基安替比林30mg ,叠氮钠100mg ,用量(图1)AOX(1)R-CH2-OH +O; +H20R-CHO + H2OzCH,"C=C . NHzCH3-C=C-N=>=02H202+ CH,-N C=0+0HCTR. CH,-N G=0+ 4H,O (2)醌亚胺(红色)收稿日期2000-11-15)男副研究员硕士从事生作者简介黄秀车19-物技术研发五悄数据24生物技术第11卷第2期1.2.2标准曲线:A0X-CTR法分别测定蒸用1%(v/v)甲醇发酵液作标准溶液。取诱馏水及发酵液中甲醇浓度,研究本方法的可导阶段的发酵液,离心收集上清。按1.2.2行性。按下表中步骤加样,混匀,37C水浴方法中所述方法进行测定其相应的Aso值,20min 508nm波长测比色绘制标准曲线。按如下公式计算:待测发酵液中甲醇浓度%( v/v )=待测样As08/1%甲醇标准液As08 x0.181.0%。0.150.123讨论专0.09醇氧化酶( AOX )属黄素氧化酶类,俗称0.06●水溶液乙醇氧化酶,FAD是它的辅助因子。该酶能发酵液0.03以一系列低级醇、不饱和醇为底物但对支链0.00醇及多元醇不起作用。( 1 )中的R - CH2OH0 123456789101112可以是甲醇、乙醇、丙醇等,但是以催化甲醇甲醇浓度(%,VIN)的效率最高。( 2 )中的过氧化氢酶也可用过氧化物酶( Peroxidase ,POD )来代替,虽然特异图1水溶液和发醇液中甲醇浓度 与醌亚胺类Asxg吸收值关系性略有改变,但对测定影响不明显。在甲醇曲线酵母发酵过程中使用的是工业级的甲醇发加入物ml)空白管待测甲醇酵中最关键的是甲醇等诱导物的浓度控制,标准溶液即使含有杂醇，这些杂醇大都可以起诱导作用所以测到的虽然不是甲醇的精确量但基蒸馏水/未诱导时发醇上清液0.02本上可反映诱导物的实际浓度。从浓度-吸甲醇标准液% w/v)光度曲线可知发酵液中的其他成分不对测定工作液3.0. 1.2.3 甲醇浓度的实际测定:取发酵液离结果产生显著影响。心收集上清用于测定按下表加样，方法同发酵时诱导阶段甲醇的最适浓度随工程菌而异,一般在0.5%_ ~ 3%之间,这正是1.2.2。AOX-CTR法测定的理想范围。需说明的甲醇标准溶液待测是,AOX-CTR测得是以甲醇为主的低级醇加入物ml )空白管( 未诱导发酵液加甲醇至1% )浓度不是甲醇的浓度,它不能取代目前测甲醇浓度的气相色谱法和亚硫酸品红比色法。未诱导时的发酵上清液0.02附醇氧化酶的制备及活力单位( I∪)标甲醇标准液1% w/v) /定醇氧化酶是甲醇酵母等微生物在以甲醇待测发醇液/为唯一碳源时大量合成的一种酶,Pichia pas-0.3toris.酵母产生的醇氧化酶在该空间结构上有缺陷所以活力较低( 6IU/mg~ 10 IU/mg酶蛋2.结果白),它是以大量合成该酶来实现对甲醇的大量利用的。如果不能购买到商品化的该酶,2.1标准 曲线可以尝试从GS115 Mut+型工程菌或宿主菌根据散点图选择甲醇浓度为0.5% ~诱导后的菌体中大量提取AOX这种自提取5%的范围的6组数据进行线性回归分析。的AOX可用于本方法,同购买Biozyme的甲醇水溶液组iy =0.0195x + 0.0036 r=AOX没有明显差别。具体提取及活力标定0.990 p<0.001 ;方法可参考美国专利(专利号:4430427、甲醇发酵液组y =0.0328x + 0.0049 r=4540668、4619898、4956290 )0.987 p<0.001。参考文献:;代表甲醇体积百分比浓度值(% ,v/[1罗平.饮料分析与检验[M]北京:中国轻工业出版社,v),y代表对应的Aso值。1992 ,101- 103从.上面的吸收曲线上可见,甲醇浓度在[2于海波刘庆河都波.酒类、饮料、食品及其原料分析0.5% ~ 5%的范围内,本法测定的线性关系方法注解M].北京:轻工业标准出版委员会,1991 ,78 .良好，,由反应终产物醌类的量可对样品(水溶[3安乙敏主编.生化检验学[ M]成都:四川科学技术出液或发酵液)中甲醇浓度进行准确测定发酵版社 ,1990 68-72.液中的其他成分对该方法的测定不构成显著[ 4 ]Hopkins. Red absorbing combination of alcohol oxidase and anazide compounC P ] United States Patent 4430427. 1984- 02影响。-07.2.2诱导阶段发酵液中甲醇浓度的测定及[5 ]Hopkins. Alohol oxidase from Pichia - type yeastC P ]. United计算States Patent 4540668. 1985- 09- 10.[6 ]HoAlcohol oxidase from Pichia - type yeast:[ P ]. United用诱导煎的发酵液上清液作空白对照并JHopkinsStates Patent 4619898. 1986- 10- 28.[ 7 ]Harrison Jr ,et al . Large scale process for the purifiction of al-第11卷第2期生物技术Vol.11 ,No.22001年4月BIOTECHNOLOGYApr 2001colhol oxidase[ P ]. United States Patent 24956290. 1990-09 -Colorimetric assay of methanol in fermentation broth of Pichia pastorisHUANG Xiu- dong' ,YANG Hong- ZHANG Gao- xial LI Shu- gang' ,YU Ting- he'( 1. Chongqing Rain Biotech Institute Chongqing 400060 2. Bioengineering Institute ofChongqing University ,Chongqing 400044 3. Institute of Utrasound Engineering inMedicine Chongqing Medical University Chongqing 400016 )Abstract :It was very important to control methanol concentration in broth of Pichia pastoris ,which iscomplicated and incessant changed. A colorimtric assay was established in this study based upon com-bined catalysis of alcohol oxidase and catalase . The results showed linear relationship was excellent within0.5% ~5% .It was an acceptable method and could determine methanol concentration rapidly .Key words :fermentation ; Pichia pastoris ;methanol alcohol oxidase中图分类号564文献标识码A文章编号:1004- 311X( 2001 )02- 0025 -03维生素C二步发酵的新组合菌系仲崇斌! ,于海2吕主奎2冯树1张忠泽'( 1.中科院沈阳应用生态所辽宁沈阳110015 2.东北制药总厂辽宁沈阳110026)要_:以掷孢酵母作为伴生菌与氧化葡萄糖酸杆菌组成新混菌体系对其产酸性能和特点进行了研究。实验室摇瓶结果显示新菌系混菌状态不同产酸不同，以KGA含量为4.8小菌/掷孢酵母为31:1种液接种时最有利于产酸增加接种生物量可提高产酸速度缩短发酵周期,但不影响最终产酸量。相同条件下新菌系产酸能力高于现有菌系酸量增加5mg/ml~7mg/ml发酵周期缩短6h~8h酸转化率提高3%~4%最高产酸点pH值下降约0.5表现出较大的产酸潜力和可修饰性。关键词:VC二步发酵2-酮基- L-古龙酸掷孢酵母氧化葡萄糖酸杆菌维生素QVc)二步发酵的第二步为混菌1.2培养基:采用掷孢酵母、氧化葡萄糖酸发酵使L-山梨糖合成Vc前体2-酮基- L杆菌及巨大芽孢杆菌适合培养基{3]。一古龙酸(KGA)最初筛选的混菌体系为氧1.3 分析方法化葡萄糖酸杆菌与条纹假单孢杆菌的组合,1.3.1生长曲线的测定光密度法(4]。前者为产酸菌(俗称小菌)后者不产酸,但可1.3.2 2-酮基-L-古龙酸含量的测定:碘促进前者产酸，也称伴生菌宁文珠以巨大量法[5]。芽孢杆菌代替条纹假单孢杆菌获得成功后1.3.2 残糖的测定蒽酮试剂法(6。经不断改进,目前生产上大多使用的混菌体系为巨大芽孢杆菌和小菌的组合,使糖酸转2结 果与讨论化率已由最初的39.7%(糖浓度7% ,6d )提高到79.5%[2。本文以掷孢酵母为伴生菌2.1新组合菌系产酸性能和特点与小菌组成新菌系具有较强的抗酸能力酸将掷孢酵母与小菌按适当比例混合接转化率提高发酵周期缩短表现出较大的产种28°振荡( 180r/min 培养_每4h取样测定酸潜力和可修饰性。菌浓、酸量、残糖和pH值,得新菌系混菌生长代谢曲线(图1》_由图可见接种后二菌1材料与方法均有一个适应期发酵前20h内,KGA合成较慢_相应的L-山梨糖下降速度也很慢这时1.1 菌株，掷孢酵母( Sporoblomyces roseus ),二菌均处于适应期和指数前期;发酵20h后,1.1.1L-山梨糖下降速度加快,KGA的积累速度Y44,由中科院生态研究所菌种室提供。也加快这时小菌处于指数期;64h 左右儿二1.1.2 巨大芽孢杆菌( Bacillus megaterium )山梨糖浓度降到最低水平,KGA积累量达最和氧化葡萄酸杆菌( Gluconobacter oxydans ),高,以后合成速度变慢基本趋于停滞。发酵2980 ,由东北制药总厂提供。过程中pH值由开始的6.5升到7.8左右随KGA的大量产生,pH值又开始下降,直至收稿日期2000- 08 - 05 ;修回日期2001-03-085.4左右。作者简介仲崇斌9每一),女，讲师硕士现在沈阳农将新组合菌系与现有菌系发酵特性进行业大学生物科技学院师事生物技术研究。