聚乙二醇化重组人干扰素α2b的质量检测

48中国生物制品学杂志2005年1月第18卷第1期Chin 」Biogcals January 2005, Vol. 18 No.1[实验技术]聚乙二醇化重组人干扰素a:2b的质量检测张雪梅郭桥吴福泉陈云声齐影朱丽娜周丽红盛军刘晶[摘要]目的建立聚乙二醇化重组人干扰索ca2b(PEC rhlFNa2b)的质量检测方法。 方法采用Wish细胞-vsv病毒系统,以CPE法测定干扰素的生物学活性,基质辅助激光解吸附^飞行时间质谱法测定相对分子质量,反向高效液相法( RP-HPLC)测定纯度,溴化氰裂解-SDS-PAGE法测定肽图,等电聚焦电泳法测定等电点,紫外分光光度法测定紫外吸收光谱。结果聚乙二醇 化重组人干扰素o2b 的比活为6.0x 10 ~ 10.0x 10 1U/mg蛋白,相对分子质量约为62 600,等电点在5.20~ 6.55之间,紫外最大吸收峰约在278 nm波长处。结论所建 立的检测方法可控制聚乙二醇化重组人干扰素ce2b质量。[关键词]重组人干扰索 a2b;聚乙二醇;化学修饰;质量检测Quality Control of PEG-rhIFNa2bZHANG Xue-mei, GUO Qiao, WU Fu-quan,et al ( Changchun Institute of Biological Products , Changchun130062, China)[Abstract] Objective To develop the methods for quality control of PEG -hIFNa2b. Methods Dtemmine the biological activity of PEG :hIFNa2b by CPE method using Wish cell-VSV system, the relative mo-lecular weight by MALDI-TOF-MS, the purity by RP-HPLC, the peptide map by SDS-PAGE afer lysis with cy-anogens bromide, the isoelectric point by isoelectric focusing electrophoresis and the ultraviolet absorption spec-tum by ultraviolet spectroscopy . Results The specific activity , relative molecular weight and isoelectric pointof PEG hIFNa2b were 6.0x 106-10.0 x 10 IU/mg protein,62 600 and 5.20-6. 55 respectively , and its maxi-mum ultraviolet absorption peak appeared at 278 nm. Conclusion The de“:loped methods were suitable forthe quality control of PEG- rhIFNa2b.[Key words] rhIFNa2b; PEG;Chemical modification;Quality control干扰素(IFN)在体内半衰期短,且长期使用易产2.仪器生抗体,影响了其药效的发挥。聚乙二醇化学修饰Biflex I型MALDI-TOF质谱仪( Bruker Daltonics的IFN(聚乙二醇化IFN)能提高了相对分子质量,并Co.); RP-HPLC所用色谱柱Agilent Zorbax Eclipse降低了免疫原性,延长了其在体内的半衰期",在临XDB-C% :4.6x 150 mm, HP1100型真空在线脱气机,床上能更好地发挥治疗作用。四元梯度泵,DAD检测器;Bio-RadMini-I垂直电泳本文建立了聚乙二醇化重组人干扰素a2b系统; BECKMAN DU-50紫外分光光度计; Phamacia( PEG-mhIFNa2b)的生物学活性、分子结构和分子特公司生产的Phast-System全自动水平电泳仪。性等质量指标的检测方法,为聚乙二醇化学修饰的3.蛋白含量检测蛋白类药物的研究与开发提供了有效的检测手段和按照2000版《中国生物制品规程》“生物制品化经验。学及其他检定方法”中微量法(Lowry)进行2]。材料与方法.4.抗病毒活性检测按照2000版《中国生物制品规程》“重组人干扰1.材料Wish细胞为本所常规传代培养,VSV病毒为本素a2b制造和检定规程”中所述方法[2]。中国煤化工所繁殖保存;干扰素国家标准品及蛋白国家标准品购自中国药品生物制品检定所;PEG:hIFNa2b为本MHC N M H G行时间质谱(MAL-DI-T0F-MS)法又SLS-rAGE测疋相对分子质量。所制备。.6.纯度检测作者单位:长春生物制品研究所(长春130062).采用SDS-PAGE法后扫描仪扫描及反向高效液中国生物制品学杂志2005年1月第18卷第1期Chin J Biologicals Jormuary 2005, Vol. 18 No.1相法(RP-HPLC) (流动相: A:0.1%三氟乙酸水溶g液[2]。B:95%乙腈的A液。梯度:B液由0% ~600100%A液,时间:0 ~ 30 min,流速:1 ml/min, 检测波500长:214 nm,柱温:25C)测定。7.肽图分析400采用溴化氰裂解后SDS-PACE法测定日。3008.等电点检测.200采用水平等电聚焦电泳法。9.紫外光吸收性质分析00按照200版《中国生物制品规程》“生物制品化20000300004000050000600007000080000学及其他检定方法”中紫外光谱检测法进行间。M结图1基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)法测定PEG-rhIFNo2b的相对分子质圉谱1.干扰素抗病毒活性Fig 1. Determination of relative molecular weight of PEG-以干扰素国家标准品为标准，检测连续3批rhlFNo2b by MALDI-TOF-MSPEG rhIFNa2b干扰素抗病毒活性、蛋白含量及比活,见表1。Mr表1 PEG-rhIFNa2b 的抗病毒活性和比活-93000Tab 1. Antiviral and speiflc activities of PEG-hIFNa2bAntiviral activityProteinSpecife activitySample(10 IU)(u/m1)(10 IU/mg)_-43000015.7567.510.0- 47 0004.6539.38.6-_14 4003.6586.8.11,5: Mr marker;2,3,4:PEG-rhFNic2b.2.相对分子质量3批PEG-hIFNa2b经MALDI-TOF-MS法测定相图2 SDS-PAGE法测定PEG-rhIFNa2b的相对分子质对分子质量约为62 600,SDS-PAGE法测得的相对分量图谱子质量约在93 000附近,见图1、图2。Fg 2. Determination of relative molecular weight of PEG-rhIFNa2b by SDS-PAGE3.纯度SDS- PAGE后扫描法测定纯度为100% ,见图3;0.800-- 0.800RP-HPLC法测定PEG -rhIFNa2b保留时间约为10.2 min,纯度为98.9%。本文检测了3批样品,并且每批样品重复检测3次,所得结果相同。4.肽图分析0.400-t 0.400采用溴化氰裂解后,干扰素被裂解成4个肽段,相对分子质量为8 200~ 12 000; PEC -rhIFNa2b也被裂解成4个肽段,与干扰素肽图不同的是,其上方有0.000-0.0002个较大相对分子质量带,其中I为未裂解的PEG-中国煤化工300hIFNa2b, I为结合了PEG大分子的肽段。其余肽段相对分子质量为9000~ 12 000,见图4、图5。对3YHC N M H Grp-htIFNa2b的纯度批样品反复检测,结果相同。表明该方法适合对图谱Fg 3. Scanning of SDS-PAGE proflePEG-rhIFNa2b做肽图分析。中国生物制品学杂志2005年1月第18卷第1期Chin J Biologicals January 2005, Vol.18 No.1扰素的免疫原性,因而在临床上能更好地发挥作用。但是,干扰素经化学修饰后,其结构和性质都发生了很大变化,原有的针对干扰素的检测方法不能完全适合。本文在对PEG-rhIFNa2b的理化和生物学性质研究的基础上,建立了一套质量检测方法。经验证,该方法准确可靠,能很好地控制其质量。hIFNa2b经PEG化学修饰后在体外抗病毒活性2512-一有较大下降,约为修饰前的8% ,这可能是由于大分子物质的化学结合影响了干扰素的空间结构,并且与干扰素化学结合的PEG的线性长链在干扰素分1:protein Mr marker;2,3,4:PEG rhIFNa2b.子周围包裹缠绕,形成了一道分子屏障,阻碍其活性圄4 PEG rhIFNa2b溴化氰裂解肽圉部位与受体的结合,从而影响了抗病毒活性的发挥。Fig 4. Peptide map of PEG-rhIFNa2b treated by CNBr有研究显示[1 ,与干扰素结合的PEG相对分子质量越大,其活性越低。然而这些结果是在体外测出的,在体内,由于受多种因素的影响,其生物学活性的发挥还有待进-步研究。由于蛋白质结合了惰性线性大分子后,其整个分子的外部形状和电场性质都发生了很大变化,PAGE法和凝胶层析法已不再适合检测其相对分子质量;MALDI-TOF-MS法所需样品量小,测量范围二E2广,精确度高,非常适合对此类样品分子量的检测。肽图分析中溴化氰裂解不完全,表明hIFNa2b修饰后稳定性明显提高;裂解后有一肽段相对分子质量较大,说明此肽段上存在与PEG结合的位点;1:rhlFNo2b;2:protein Mr marker.其余肽段位置与修饰前相同。.本文所建立的方法基于PEG-thIFNa2b 的性质,圄5 rhIFNa2b 溴化氰裂解肽圄简单易行,精确度高,能较好地控制PEC-hIFNa2bFig 5.Peptide map of rhIFNa2b treated with CNBr质量,同时也为类似的生物制品提供了可靠的检测方法。5.等电点检测经检测3批样品等电点为5.2 ~ 6.55,而hIFNa2b畚考文献的等电点应为4.0 ~ 6.7,表明hIFNa2b经PEG修饰[1] Jeng sT, Byun SM. Decresed agutinablil d meaypx-lyethyle后,其等电点没有改变。gycol ttachedl rod blood cells: sgifcance屿a blood sbtute. Atif6.紫外光谱检测Cells Blood Subesit Immbil Biotechnol, 196,24:503-511.1经检测最大吸收峰约为278 m,说明hIFNa2b[2]中国生物制品规程2000经PEG修饰后紫外最大吸收值没有改变。[3]张龙翔,主编.生化实验方法和技术.第2版.北京:高等教育出版社1997.100- 116.6[4] Megof P. Beaiotis AC, Maskiewicz R. Analyi's of plythylene gyolmodifed superoide disnutase by chromalographic, light sttring,重组人干扰素a2b经聚乙二醇化学修饰后相对chernical and enzymatic mithods. Chem Parm Bull Val, 1988, 36(8):分子质量明显增加,从而延长了其在体内的循环时3079-3089.间,同时由于免疫惰性大分子的遮蔽作用,降低了干中国煤化工YHc N M H口L2_0回200402)2